西瓜種質資源表型精準鑒定技術方案

李娜 尚建立 周丹 王吉明 馬雙武

摘 ? ?要： 表型性狀是遺傳物質在特定環境下的具體表現，是進行種質/品種評價和遺傳多樣性研究的重要組成部分。筆者根據120份不同生態型的栽培西瓜種質在代表我國西北、華北和華南生態區的新疆昌吉、河南新鄉和海南三亞進行2 a（年）的品質、形態特征和生物學特性等22個重要性狀的表型精準鑒定，以及在枯萎病抗性鑒定、病毒病抗性鑒定、耐濕熱鑒定的基礎上，形成了規模化的西瓜種質資源表型精準鑒定方案，為西瓜種質資源分發利用、種質創新和基因挖掘提供參考，也可為西瓜新品種定向選育奠定基礎。

關鍵詞： 西瓜; 資源; 核心種質; 表型; 精準鑒定

中圖分類號： S651 文獻標志碼： B 文章編號： 1673-2871（2020）11-94-05

為了解決西瓜種質表型性狀鑒定標準不統一、鑒定數據不準確、利用不便和利用效率低等問題，筆者課題組開展了不同優勢生產區域西瓜核心種質資源多年的表型精準鑒定和多年的抗性鑒定，基于筆者課題組老師主編或參與的《西瓜種質資源描述規范和數據標準》[1]和《農作物優異種質資源評價規范 西瓜》（NY/T 2387—2013）[2] 等著作或標準形成了規模化的西瓜種質資源表型精準鑒定技術方案，使表型數據的采集更加標準化，為西瓜種質資源分發利用、創新種質的篩選和創制提供參考，也為西瓜抗性和重要園藝性狀的基因挖掘、全基因組分子輔助育種、分子標記輔助育種奠定堅實的基礎。

1 試驗材料

通過原有表型和基因型分析，從“國家西瓜甜瓜中期庫”中的西瓜種質資源中選出120份不同生態型的栽培西瓜為材料。

2 田間試驗設計及管理

選擇能夠代表我國西北生態區、華北生態區和華南生態區的新疆昌吉、河南新鄉和海南三亞作為試驗點，每個試驗點分別鑒定2 a。采用催芽播種，春夏生長期地膜覆蓋露地栽培（新疆昌吉試驗基地、河南新鄉試驗基地2017年和2018年5—8月，海南三亞試驗基地2017年12月至2018年4月、2018年12月至2019年4月），每份種質重復3次，隨機區組設計，每次重復定植10株，行距2.0 m，株距0.4 m，雙蔓整枝，自然坐果，每株留1果（同一種質不同重復間坐瓜節位盡可能保持一致），試驗地周圍設置保護行。試驗地按當地肥水水平管理，果實充分成熟后采收，并按小區、單瓜進行性狀調查和采種，種子及時晾干并干燥處理。

枯萎病抗性鑒定和病毒病抗性鑒定選擇苗期鑒定方法，2018—2019年春季在中國農業科學院鄭州果樹研究所所部溫室內進行。采用營養缽育苗，營養缽大小為8 cm×8 cm，每份種質3次重復，隨機排列，每個重復50粒種子，每個營養缽5粒種子。

耐濕熱鑒定在課題組實驗室的恒溫培養箱內進行。每份種質3次重復，每個重復30粒種子。

3 表型鑒定方案

本方案進行精準鑒定的表型性狀，涉及到西瓜重要的抗性性狀、品質性狀、形態特征和生物學特性。抗性性狀包括枯萎病抗性鑒定、病毒病抗性鑒定、耐濕熱鑒定;品質性狀包括中心可溶性固形物含量和瓜瓤質地;形態特征和生物學特性包括株型、雌花兩性花、子房形狀、主蔓長度、坐果距離、果粉、果實質量、果皮硬度、果皮底色、果皮覆紋形狀、果實形狀、瓜瓤顏色、果實長度、果實寬度、果形指數、果皮厚度、種子長度、種子寬度、種子厚度、種子千粒重。

參照《西瓜種質資源描述規范和數據標準》[1]，結合實際操作中的流程改良設計并完成本實驗方案。

3.1 西瓜抗性鑒定

3.1.1 枯萎病抗性鑒定[3] 西瓜枯萎病病菌為尖孢鐮刀菌西瓜專化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveurm）生理小種1菌種由本實驗室使用菌土保存法保存。

菌株活化：用保存的菌土育苗，待瓜苗發病后，采用組織分離法分離病原菌。取病苗根莖接合部上下各約1.0 cm的莖部，清水沖洗晾干，切成約0.5～1.0 cm的小段，消毒后接種于滅菌的PDA培養基平板上，于25 ℃恒溫培養箱中暗培養2 d后，光照培養約3 d至平板上長出紫紅色孢子。將麥粒提前1 d浸泡，煮至熟透，濾干水分，分裝，121 ℃滅菌20 min備用。在長滿孢子的PDA平板上加入無菌水，輕輕搖晃使孢子散入水中。將含有孢子體的水倒入麥粒中，在28 ℃恒溫培養箱培養至紫紅色菌體長滿麥粒（5～7 d）。

菌土準備：將長滿尖孢鐮刀菌的麥粒磨碎后，與滅菌的沙土1∶50（體積比）混勻備用。

種子準備：每份種質種子使用0.1%高錳酸鉀溶液消毒后用濕布包好室溫浸種16 h，甩干水分后，在33 ℃恒溫培養箱催芽36 h。

接種鑒定：將準備好的菌土用營養缽裝好，溫室內加溫苗床播種，設感病、抗病對照品種和保護行。抗性對照品種為‘Sugarlee（中期庫號ZXG00261），感病對照品種為‘蜜寶（中期庫號ZXG00216）。

病情調查：出苗結束后拔除畸形苗，統計出苗數，10 d后開始發病并記載發病情況，4周左右待感病對照品種達到感病水平后統計各重復的活苗數，計算死苗率。

死苗率/%=100×（出苗數-活苗數）/出苗數。

抗病性分級標準如下：

高抗（HR），0≤死苗率≤20%，賦值1;抗病（R），20%<死苗率≤40%，賦值3;中抗（MR），40%<死苗率≤60%，賦值5;感病（S），60%<死苗率≤80%，賦值7;高感（HS），死苗率>80%，賦值9。

3.1.2 病毒病抗性鑒定[4] 小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）病毒株由中國農業科學院鄭州果樹研究所古勤生博士惠贈。

種子準備：每份種質種子使用0.1%高錳酸鉀溶液消毒后用濕布包好室溫浸種16 h，甩干水分后，在33 ℃恒溫培養箱催芽36 h后播種于裝有滅菌基質的營養缽中。

接種鑒定：在西瓜幼苗子葉平展期進行接種。剪取攜帶植物病毒的葉片，放在研缽中并加入適量磷酸緩沖液研磨成汁液。澆透后，水噴濕葉面，在植物幼嫩的葉面上灑少許金剛砂，用紗布蘸取少量病樣汁液在灑了金剛砂的葉面上朝同一方向輕抹2～3次。接種后蓋膜保濕，遮陽網遮陰暗培養2 d。之后去掉遮陽網溫室常規生長。設感病和抗病對照品種，抗病對照品種為‘PI 595203（中期庫號ZXG001562），感病對照品種為‘Sugarlee（中期庫號ZXG00261）。

病情調查：接種1周后開始觀察葉片癥狀表現，接種35 d后調查發病情況：0級：無任何感病癥狀;1級：個別葉片褪綠斑或明脈;2級：輕度花葉，形狀正常;3級：嚴重花葉，形狀正常;4級：嚴重花葉，葉片輕微變形;5級：嚴重花葉，葉片嚴重畸形。

抗病性分級標準如下：

病情級數計算：RI=∑xini/N（RI-平均病情級數;i-病害分級的各個級別;xi-病害級別;ni-相應病害級別的株數;N-調查總苗株數），抗病性分級如下：

高抗（HR），RI<1.0，賦值1;抗（R），1.0≤RI<2.0，賦值3;中抗（MR），2.0≤RI<3.0，賦值5;感（S），3.0≤RI<4.0，賦值7;高感（HS），RI≥4.0，賦值9。

3.1.3 耐濕熱鑒定[5-6] 每份種質種子用濕布包好室溫浸種16 h，甩干水分后，分別放入高溫處理（40 ℃）和最適發芽溫度（33 ℃）的恒溫培養箱催芽。從處理的第3天起每天統計種子的發芽數，至第7天各處理發芽種子數不再增加視為完全發芽。

發芽率/%=（7 d內正常發芽的種子數/試驗種子總數）×100;

發芽勢/%=（4 d內正常發芽的種子總數/試驗種子總數）×100;

相對發芽率/%=（40 ℃處理發芽率/33 ℃處理發芽率）×100;

相對發芽勢/%=（40 ℃處理發芽勢/33 ℃處理發芽勢）×100;

根據每份種質的相對發芽率和相對發芽勢，分抗性級別如下：

強（相對發芽勢、相對發芽率≥70%），賦值3;中（30%≤相對發芽勢、相對發芽率<70%），賦值5;弱（相對發芽勢、相對發芽率<30%），賦值7。

3.2 西瓜重要園藝性狀精準鑒定

3.2.1 株型 開花坐果盛期，目測觀察每株植株生長狀態和枝葉的疏密程度，如圖1：

叢生：（伸蔓晚，基部葉片多而緊密，蔓上葉片節間短、密，蔓分枝少、短），對照品種為‘日本短蔓（中期庫號ZXG00143），賦值1;

緊湊（伸蔓正常，基部葉片少而疏，蔓上葉片節間較短、較密，蔓分枝較少、較短），對照品種為‘96B41（中期庫號ZXG00152），賦值2;

疏散（伸蔓正常，基部葉片少而疏，蔓上葉片節間長、稀，蔓長），對照品種為‘鄭引64號（中期庫號ZXG00104），賦值3。

3.2.2 雌花兩性花 開花坐果盛期，目測觀察每株主蔓至少2朵雌花中有無正常雄蕊，如圖2：

單性花（雌花柱頭周圍沒有雄蕊），對照品種為‘96B41（中期庫號ZXG00152），賦值0;

兩性花（雌花柱頭周圍有雄蕊并能產生正常的花粉），對照品種為‘火星（中期庫號ZXG00988），賦值1。

3.2.3 子房形狀 開花坐果盛期，目測觀察每株主蔓上至少2朵雌花子房側面呈現的形狀，如圖3：

圓（縱徑和橫徑基本相同），賦值1;橢圓（介于圓和長之間），賦值2;長（縱徑明顯大于橫徑，顯得細長），賦值3。

3.2.4 主蔓長度 果實成熟采收時，用卷尺測量主蔓從子葉節到蔓頂端的最大距離，單位為m，精確到0.1 m。

3.2.5 坐果距離 果實成熟采收時，目測70%植株的坐果位置，并用卷尺測量主蔓子葉節到坐瓜節位之間的瓜蔓長度，單位為m，精確到0.1 m。

3.2.6 果粉 果實成熟采收時，目測和手拂的方法觀察果實表面是否附著一層白色粉狀物，如圖4：

無（果實表面無白色的粉狀物，用手拂過時沒有果粉脫落），對照品種為‘撫州瓜（中期庫號ZXG00386），賦值0;

有（果實表面有一層白色的粉狀物，用手拂過時有明顯的果粉脫落），對照品種為‘鄭引64號（中期庫號ZXG00104），賦值1。

3.2.7 果實質量 果實成熟采收時，用秤秤出成熟果實的質量，單位為kg，精確到0.1 kg。

3.2.8 果皮硬度 果實成熟采收時，用硬度計測量果皮陽面中部的硬度值，單位為kg·cm-2，精確到0.1 kg·cm-2。

3.2.9 果皮底色 果實成熟采收時，參照RHS植物比色卡上最接近代碼的顏色特征目測確定果實表面最底層的顏色或覆紋間的顏色：

黃（FAN1 6 A），對照品種為‘黃金皮-3（中期庫號ZXG00088），賦值1;綠白（FAN4 192 D），對照品種為‘河南三白瓜（中期庫號ZXG00188），賦值2;淺綠（FAN3 134 C），對照品種為‘紅寶石（中期庫號ZXG00349），賦值3;綠（FAN3 140 A），對照品種為‘美國大花皮（中期庫號ZXG00790），賦值4;深綠（FAN3 135 A），對照品種為‘火星（中期庫號ZXG00988），賦值5;墨綠（FAN4 189 A），對照品種為‘PI 502319（中期庫號ZXG02079），賦值6。

3.2.10 果皮覆紋形狀 果實成熟采收時，目測的方法觀察果實表皮的覆紋呈現的形狀，如圖5：

網紋（覆紋呈連續的細網狀，經過的地方果皮底色可見，邊緣不明顯），對照品種為‘鄭引65號（中期庫號ZXG01517），賦值1;齒條（覆紋呈連續的窄條狀，經過的地方果皮底色不可見，有鋸齒狀突出、邊緣明顯），對照品種為‘紅寶石（中期庫號ZXG00349），賦值2;條帶（覆紋呈連續的寬條狀，經過的地方果皮底色不可見，有斑狀突出、邊緣不明顯），對照品種為‘All Sweet 3-1（中期庫號ZXG00445），賦值3;放射條（覆紋呈不連續的條狀，經過的地方果皮底色不可見，呈斑塊輻射狀、邊緣不明顯），對照品種為‘滿堂紅（中期庫號ZXG01514），賦值4;斑點（覆紋呈不連續的斑點狀，經過的地方果皮底色不可見，在果皮上不規則分布、邊緣明顯），對照品種為‘Moon and Star（中期庫號ZXG01626），賦值5。

3.2.11 果實形狀 果實成熟采收時，目測果實的形狀，如圖6：

圓（縱徑和橫徑基本相同），對照品種為‘太陽西瓜（中期庫號ZXG01304），賦值1;橢圓（介于圓和長之間），對照品種為‘PI 635594（中期庫號ZXG01854），賦值2;長（縱徑明顯大于橫徑），對照品種為‘菲88-110（中期庫號ZXG01307），賦值3。

3.2.12 瓜瓤顏色 果實成熟采收時，用刀沿果實中心縱切后，參照RHS植物比色卡上最接近代碼的顏色特征目測確定果實縱切后瓜瓤所呈現的顏色，果實剖面拍照備查：白，對照品種為‘河南三白瓜（中期庫號ZXG00188），賦值1;乳白（FAN4 N155 B），對照品種為‘PI 279462（中期庫號ZXG02017），賦值2;黃（FAN1 5 A），對照品種為‘黃玫（中期庫號ZXG00185），賦值3;橙黃（FAN1 17 B），對照品種為‘太原1號（中期庫號ZXG00655），賦值4;粉紅（FAN1 55 B），對照品種為‘96B41（中期庫號ZXG00152），賦值5;大紅（FAN1 45 AB），對照品種為‘鄭引43號（中期庫號ZXG00090），賦值6。

3.2.13 中心可溶性固形物含量 果實成熟采收時，用刀沿果實中心縱切后，用手持折光儀測定果實中心瓜瓤可溶性固形物含量，以%表示。

3.2.14 瓜瓤質地 果實成熟采收時，用刀沿果實中心縱切后，用品嘗的方法根據口感的軟硬、致密程度和汁液多少綜合評價瓜瓤質地：

軟（瓜瓤質地較松、汁液少），對照品種為‘紅籽瓜（中期庫號ZXG00637），賦值1;沙（瓜瓤質地松、汁液少），對照品種為‘阜陽3號（中期庫號ZXG00154），賦值2;脆（瓜瓤質地實、汁液多），對照品種為‘96B41（中期庫號ZXG00152），賦值3;硬（瓜瓤質地很實、汁液較多），對照品種為‘PI 174103（中期庫號ZXG01946），賦值4。

3.2.15 果實長度 果實成熟采收時，用刀沿果實中心縱切后，用卷尺測量果實縱切面從基部邊緣到頂部邊緣之間的最大距離，單位為cm，精確到0.1 cm。

3.2.16 果實寬度 用卷尺測量3.2.15中選取果實縱切面與果實縱軸垂直方向兩邊緣之間的最大距離，單位為cm，精確到0.1 cm。

3.2.17 果形指數 根據3.2.15和3.2.16每個果實的長度和寬度數據，計算出果實的果形指數。果形指數=果實長度/果實寬度。

3.2.18 果皮厚度 用卷尺測量3.2.15中選取果實果皮陽面中部從外果皮到內果皮之間的距離，單位為cm，精確到0.1 cm。

3.2.19 種子長度 在果實成熟采收后，每個果實采收的種子中隨機選取20粒飽滿的種子，測量結束后放回混勻，再隨機選取，共3次。用游標卡尺測量每粒種子喙部到尾部邊緣之間的最大距離，單位為mm，精確到0.01 mm。60次測量的平均值作為該果實種子厚度的性狀值。

3.2.20 種子寬度 用游標卡尺測量3.2.19中選取種子種面與種子縱軸垂直方向兩邊緣之間的最大距離，單位為mm，精確到0.01 mm。60次測量的平均值作為該果實種子厚度的性狀值。

3.2.21 種子厚度 用游標卡尺測量3.2.19中選取種子平放時上下表面之間的最大距離，單位為mm，精確到0.01 mm。60次測量的平均值作為該果實種子厚度的性狀值。

3.2.22 種子千粒重 在果實成熟采收后，每個果實采收的種子中隨機選取20粒飽滿的種子，測量結束后放回混勻。用千分之一的天平稱重，單位為g，精確到0.01 g。20粒重換算為千粒重。3次測量值的平均值作為該果實種子千粒重的性狀值。

4 數據處理及分析

每個試驗點有3次重復，每次重復至少取5個樣品。目測、品嘗等感官質量數據的采集需具有專業知識的人員至少3人同時進行。所采集數量性狀的數據，根據3次重復的觀測值，使用Excel軟件統計每個試驗點性狀的最大值、最小值、平均值、變異系數和標準差，特異的測量值做缺失處理，平均值做為該試驗點種質的性狀值。計算每份種質不同試驗點性狀值的平均數、變異系數和標準差，并利用SAS的Anova程序進行方差分析，判斷試驗結果的穩定性和可靠性。結合試驗點當年的環境條件判斷數據的合理性和特定性狀數據整體差異的原因。生長不正常的年份和小區數據不予統計。

參考文獻

[1] 馬雙武，劉君璞，等.西瓜種質資源描述規范和數據標準[M]. 北京：中國農業出版社，2005.

[2] 農業部種植業管理司. 農作物優異種質資源評價規范西瓜：NY/T 2387—2013[S]. 北京：中國標準出版社，2013.

[3] 李娜，王吉明，尚建立，等. 西瓜枯萎病生理小種1抗性QTL精細定位與InDel標記開發[J]. 中國農業科學，2017，50（1）：131-141.

[4] 尚建立，王吉明，馬雙武. 西瓜抗小西葫蘆黃花葉病毒種質資源鑒定[J]. 中國瓜菜，2014，27（4）： 14-15.

[5] 周丹，王吉明，李娜，等.西瓜種子萌發期的耐冷性和耐熱性[J]. 中國瓜菜，2018，31（11）： 26-30.

[6] 張力. 西瓜耐熱性指標鑒定及材料篩選研究[D]. 南寧：廣西大學，2014.