樟子松和黑皮油松人工林土壤細菌群落多樣性比較研究

徐 穎，庾嘉欣，于 淼，孫廣玉

(東北林業大學生命科學學院，哈爾濱 150040)

0 引言

土壤微生物作為土壤中的重要分解者，在森林土壤生態系統能量流動與物質循環中起著重要的調控作用[1]。土壤微生物不僅參與有機質的分解，促進腐殖酸的形成，還能改善土壤結構，促進植物吸收，增加植物抗性，為地上植被儲備養分提供了有利條件[2]。細菌在土壤微生物總量占比中超過半數，在土壤微生物群落中具有代表意義[3]。土壤細菌是森林生態系統中植物多樣性和生產力的重要驅動者，可促進土壤中有機物質的分解并使其轉化為土壤的營養物質，提高土壤肥力和改善土壤環境[4]。土壤細菌與地上植物有著緊密聯系[5]，分析土壤細菌群落結構特征有利于了解地上植物的多樣性。

樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica，簡寫Ps)和黑皮油松(Pinustabulaeformis.var.mukdensis，簡寫Pt)均為松科植物，是我國三北地區主要優良造林樹種[6]，因其耐嚴寒、抗干旱、耐瘠薄、適應性強、觀賞性高、抗病蟲害和防風固沙能力強等特點而被廣泛栽培[7]，是我國重要的防護造林和園林綠化樹種。其中，樟子松和黑皮油松的松針還富含多種活性成分及蛋白質等營養成分[8]，具有抗腫瘤、抗氧化等多重藥理活性[9]。近些年，國內外學者對樟子松和黑皮油松人工林的研究大多集中于地上部分的撫育技術、生長規律、水分利用、林分結構和營造技術等方面[10]。李日勝等[11]介紹了油松和樟子松的容器育苗技術，可降低成本，提高造林成活率。白結冰等[12]對油松和樟子松的抗旱水分生理進行了研究，表明樟子松的抗旱性要優于油松。李國華等[13]比較了木蘭圍場陡坡地段兩種林分的生長狀況和造林成效，其中油松的存活率高，樟子松人工林地徑和樹高較高，該環境更有利于樟子松的生長。對于地下部分，鄧繼峰等[14]主要研究不同坡位對油松和樟子松人工林土壤養分特征和生長性狀的影響，對樟子松和黑皮油松人工林土壤微生物研究較少。為進一步了解樟子松和黑皮油松人工林細菌群落，比較樟子松和黑皮油松細菌群落多樣性和結構差異，利用高通量測序技術對樟子松和黑皮油松人工林土壤細菌群落進行研究與分析，以期為人工林培育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于黑龍江省哈爾濱市東北林業大學城市林業示范基地(45°43′10″N，126°37′15″E)，海拔136～140 m。哈爾濱市北鄰小興安嶺山區，東南靠張廣才嶺支脈丘陵，中部有松花江流經，山勢不高，平原遼闊，屬溫帶季風性氣候，四季分明，冬季漫長寒冷，夏季短暫涼爽，1月份最冷，平均溫度-13.1℃～-24.6℃，7月份最熱，平均溫度18.3℃～22.7℃，無霜期一般為136 d[15]。

1.2 樣品采集與處理

從哈爾濱市東北林業大學城市林業示范研究基地選取樟子松和黑皮油松人工林樣地采集土樣(避免雨季)。按5點法在每個樣地用土鉆距離根基10 cm、深度為0～10 cm進行取樣，除去雜物后，進行充分混合，過2 mm的篩，作為1個根區的土壤樣品，共獲得6個樣品(2種林型×3個重復樣本)，于-20 ℃冷凍保存，用于提取DNA。在采集土壤樣品前，去除地表的枯枝落葉。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤微生物總DNA提取

采用DNeasy PowerSoil Kit試劑盒提取土壤微生物總DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA樣品進行檢測。

1.3.2 PCR擴增及測序

樣品總DNA提取后，以微生物總DNA為模板，以細菌V3+V4區特異性引物進行PCR擴增。采用Illumina MiSeq測序平臺對PCR擴增產物進行雙端測序分析，委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成測序。

1.4 數據處理與分析

測序數據通過軟件進行過濾優化和雙端序列的連接，優質序列進行聚類，獲得OTU統計豐度信息。根據Silva細菌數據庫進行物種注釋和分類，確定序列的分類信息，獲得門、綱、目、科和屬各水平下的分類單元。基于OTU豐度信息，利用R語言工具繪圖，利用Mothur軟件計算Alpha多樣性，利用Excel 2010和DPS軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 細菌DNA測序數據分析

通過Veen圖(圖1)可知，在97%相似水平上，Ps和Pt細菌群落中共有OTU數量為2 138個，特有OTU數量分別為253和584個。將序列進行隨機抽樣，以抽到的序列數與它們所代表的 OTU 數目構建Rarefaction曲線(圖2)，Rarefaction曲線反映了樣品文庫測序數據量的合理性，可用于評價測序數據能否覆蓋所有類群。通過Ps和Pt人工林土樣的細菌Rarefaction曲線可知，隨著測序數量的增大，其所對應OTU的數目增加，各土樣的曲線均呈先上升后趨于平緩的趨勢。同時各土樣的細菌Coverage指數均高達98%以上(表1)，說明本研究樣品文庫測序數據量合理，可以反映樣本中微生物的真實情況。

圖1 土壤樣品細菌群落OTU分布的Veen圖Fig.1 Veen map of OTU distribution of bacteria communities in soil samples Ps:樟子松(Pinus sylvestris var.mongolica)；Pt:黑皮油松(Pinus tabulaeformis.var.mukdensis) 下同 The same below

圖2 土壤樣品細菌群落的稀釋曲線Fig.2 Attenuation curves of bacterial communities in soil samples

表1 土壤樣品細菌群落豐度和多樣性指數Tab.1 Community richness and diversity index of bacterial in soil samples

2.2 土壤樣品細菌群落豐度及多樣性

Shannon指數評估物種的多樣性，數值越大，說明群落多樣性越高。ACE 和Chao指數評估物種的豐富度。由表1可知，在97%分類水平下，Ps和Pt土壤細菌群落的Shannon指數分別為6.19和6.52，Pt土壤樣品ACE和Chao指數顯著高于Ps ，說明Ps和Pt土壤細菌群落結構存在差異，Pt比Ps土壤細菌的多樣性和豐富度更高。

2.3 土樣樣品群落組成分析

圖3展示了細菌在門水平上相對豐度>1%的物種組成，相對豐度<1%計為其他(other)。2種人工林土樣細菌群落共聚類32個門，76個綱，149個目，277個科，445個屬，972個種。其中Ps和Pt土樣細菌群落在門水平上主要分為：Proteobacteria(變形菌門)(39.32%，33.55%)、Acidobacteria(酸桿菌門)(27.06%，24.54%)、Actinobacteria(放線菌門)(10.63%,12.72%)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)(4.52%，5.03%)、Bacteroidetes(擬桿菌門)(5.00%，4.33%)、Chlorofleixi(綠彎菌門)(3.75%，5.38%)、Verrucomicrobia(疣微菌門)(2.42%，4.24%)、Saccharibacteria(2.03%，3.13%)、Parcubacteria(0.89%，1.40%)和Nitrospirae(硝化螺旋菌門)(0.83%，1.15%)。其中：Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)和Actinobacteria(放線菌門)為優勢門，其總相對豐度在Ps和Pt土樣中分別高達77.01%和70.81%。

圖3 土壤樣品在門水平上細菌群落相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacterial communities in soil samples at phylum level

由圖4和圖5可知，2種人工林土樣在屬水平上的細菌群落相對豐度明顯不同。Ps相對豐度排名前3的是norank-f--Acidobacteriaceae--Subgroup-1-、Rhizomicrobium和Bryobacter，Pt相對豐度排名前3的是norank-f--Acidobacteriaceae-Subgroup-1-、norank-c-Acidobacteria、RB41。Ps和Pt的主要優勢屬均為norank-f-Acidobacteriaceae--Subgroup-1-，相對豐度分別為7.76%和4.80%。Rhizomicrobium是Ps第二優勢屬，相對豐度為6.22%，但在Pt中僅占3.68%。RB41是Pt第三優勢屬，相對豐度為3.89%，但在Ps中沒有顯示豐度值。根據物種聚類數可知(圖6)，將土壤16SrDNA細菌Heat map圖劃分為7個Cluster，Ps相對豐度前10的屬在Cluster5和Cluster7，Pt相對豐度前10的屬在Cluster5、Cluster6和Cluster7。Cluster6的主要屬為RB41、Sphingomonas、norank-p--Saccharibacteria和norank-f--DA101-soil-group，故Cluster6的主要屬可能是影響Ps和Pt的差異屬。

圖4 樟子松土壤樣品在屬水平上細菌群落相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial communities in Ps soil sample at genus level

圖5 黑皮油松土壤樣品在屬水平上細菌群落相對豐度Fig.5 Relative abundance of bacterial communities in Pt soil sample at genus level

3 討論與結論

本研究利用高通量測序技術分析了樟子松和黑皮油松土壤細菌群落組成和多樣性。結果顯示，不同人工林土壤微生物群落結構存在一定的差異。黑皮油松人工林土壤樣品細菌群落的多樣性指數和豐富度指數均顯著高于樟子松。有研究表明，植被類型是影響土壤微生物多樣性的重要因素之一[16]，不同植被類型的樹木。通過其凋落物的分解，養分回歸到土壤中，為土壤微生物提供主要營養物質[17]。而土壤凋落物和根系分泌物不同，土壤的養分、含水量和酸堿度等因素也會有所不同，從而導致土壤微生物多樣性存在較大差異[18]。在本試驗中，黑皮油松人工林土壤樣品采集地樹種較為豐富，而樟子松人工林植被較單一，地上植被物種組成的多樣性，是黑皮油松土壤細菌多樣性和豐富度較高的原因之一。在土壤養分方面，黑皮油松人工林有黑皮油松、水曲柳、黃檗和榆樹等植物，土壤凋落物豐富，有助于土壤養分循環利用，促進土壤微生物繁殖，使細菌群落較豐富；而樟子松人工林植被單一，凋落物較少，土壤養分匱乏，不利于土壤微生物的繁殖生長[19]。土壤含水量同樣影響土壤細菌的多樣性。唐菊秀等[20]研究表明油松持水力也高于樟子松，黑皮油松人工林土壤含水量相對較高。本試驗中，黑皮油松人工林的林分郁閉度較大，土壤水分不易蒸發，土壤含水量較高；而樟子松人工林的林分郁閉度較小，土壤含水量較低。研究表明，土壤細菌在獲取養分過程中，更依賴于水膜的流動[15]，因此水分含量較高的黑皮油松人工林土壤細菌更容易獲取養分，更有利于細菌的生長和繁殖。在土壤酸堿度方面，黑皮油松人工林土壤pH值低于樟子松人工林[21]，可能導致了其細菌群落的多樣性差異，因此黑皮油松人工林土壤微生物細菌群落具有較高的多樣性和豐富度。

在門分類水平上，樟子松和黑皮油松人工林排名前十的門沒有差異，主要優勢門均為Proteobacteria、Acidobacteria和Actinobacteria，這與前人研究表明的東北黑土區主要細菌群落結構組成一致[22]。樟子松和黑皮油松人工林在屬水平上的細菌群落相對豐度明顯不同，RB41、Sphingomonas、norank-p--Saccharibacteria和norank-f--DA101-soil-group可能是影響樟子松和黑皮油松人工林差異的關鍵屬。其中，Sphingomonas能夠提高植物抗逆性，被視為植物益生菌，有利于植物的生長繁殖[23]。本研究中鞘氨醇單胞菌屬是黑皮油松人工林優勢屬，進一步證實了黑皮油松和樟子松人工林土壤環境和凋落物的不同，導致其土壤內部生態系統的循環產生差異，影響微生物對養分的吸收與利用，可能是引起土壤細菌群落在屬水平上有較大差異的原因。

綜上所述，黑皮油松人工林土壤細菌群落具有較高的多樣性和豐富度；樟子松和黑皮油松人工林土壤細菌群落優勢門一致；樟子松人工林和黑皮油松人工林土壤細菌群落屬水平差異大；RB41、Sphingomonas、norank-p--Saccharibacteria和norank-f--DA101-soil-group是導致樟子松和黑皮油松人工林差異的關鍵屬，后續研究應重點關注。