廣葉繡球菌液體菌種培養條件優化

馬 璐 楊 馳 肖冬來 應正河 江曉凌 劉曉瑜 林衍銓

廣葉繡球菌液體菌種培養條件優化

馬 璐 楊 馳 肖冬來 應正河 江曉凌 劉曉瑜 林衍銓*

（福建省農業科學院食用菌研究所，特色食用菌繁育與栽培國家地方聯合工程研究中心，福州 350014）

為獲得菌球密度高、直徑小和活力強的廣葉繡球菌液體菌種，經優化試驗，得到適宜培養條件為培養基初始pH 5.0，裝液量140～170 mL，接種量9%，搖床轉速120～150 r/min；并確定液體菌種的適宜培養終點為9～10天，此時菌球直徑1.07±0.03 mm，菌球密度111±11.53 個/mL，接種后菌絲生長速度2.34±0.18 mm/d。

液體培養；培養條件；培養終點；菌絲活力

廣葉繡球菌（）又名繡球菌，是一種“藥食同源”的大型真菌，營養豐富且富含活性多糖（β-葡聚糖）[1]。現代醫學研究證實，繡球菌具有抗腫瘤[2]、免疫調節[3]、促進傷口愈合[4]及提高造血功能[5]等多種保健功效。

目前，繡球菌工廠化栽培均采用瓶裝木屑菌種，原種培養時間50～55天。液體菌種菌齡一致、制備周期短，便于機械化接種，更適合食用菌工廠化生產。目前繡球菌液體培養研究多以提高次生代謝產物[6, 7]或菌絲生物量[8-10]為主，菌絲生物量最大時的菌球活力情況卻少有關注。

繡球菌液體培養初期，菌球表面有呈絨毛狀的毛刺，此時菌絲活力最強，但生物量較小；隨著培養時間延長，菌球表面逐漸光滑，菌絲生物量增大，但菌絲活力下降。因此，菌絲生物量在一定程度上不應作為判斷液體菌種優劣的首要指標。理想的液體菌種應在保證一定菌絲生物量前提下，減小菌球直徑、增大菌球密度、提高菌球活力。

前期研究已獲得繡球菌液體培養的適宜培養基配方[11]，但獲得的菌球直徑較大而密度較小。本實驗在此基礎上，優化液體菌種培養條件，勻漿處理后進行擴繁，并確定液體菌種培養終點，為繡球菌工廠化栽培中液體菌種制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

廣葉繡球菌（）（閩認菌2013005）菌種由福建省農業科學院食用菌研究所提供。

1.2 培養基

①母種培養基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉16 g/L。②PDPK液體培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，魚粉蛋白胨3 g/L，KH2PO43 g/L。③液體菌種培養基：葡萄糖40 g/L，玉米粉30 g/L，魚粉蛋白胨3 g/L。④液體菌種培養基：葡萄糖20 g/L，面粉4 g/L，魚粉蛋白胨3 g/L。

1.3 實驗方法

（1）菌種活化及培養。母種接種于PDA培養皿中24～25 ℃避光倒置培養25天后，從活化菌落邊緣挑取菌塊（=6 mm）接種至PDPK液體培養基中（250 mL三角瓶，裝液量100 mL），24～25 ℃、150 r/min避光培養10天，得活化菌種。

（2）液體菌種培養采用250 mL三角瓶，裝液量100 mL，對液體菌種培養條件，包括培養基初始pH、溫度、轉速、接種量，進行單因素試驗，避光培養20天后測定菌球密度、菌絲體生物量。具體實驗水平如下。

培養基初始pH：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0（滅菌后用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調節），接種量8%（/），培養溫度24～25 ℃，轉速150 r/min。

接種量（/）：3%、6%、9%、12%、15%，初始pH自然，培養溫度24～25 ℃，轉速150 r/min。

培養溫度：22、23、24、25、26 ℃，初始pH自然，接種量8%（/），轉速150 r/min。

設置搖床轉速：120、150、180、210 r/min，初始pH自然，接種量8%（/），培養溫度24～25 ℃。

（3）液體菌種制備。根據上述實驗結果，對繡球菌液體菌種進行培養（250 mL三角瓶，裝液量100 mL），培養結束后用勻漿機打碎（5 000 r/min，10 s），以接種量8%（/）接種至液體菌種培養基，轉速180 r/min，24～25 ℃培養。接種4天后，每隔2天測定培養液pH、菌球直徑、菌球密度、菌球體積、菌絲體生物量、培養液還原糖含量和菌絲生長速度，分析菌種活力，確定培養終點。

1.4 測定指標

（1）培養液pH。培養結束后，采用pH計（奧豪斯，ST3100）測定培養液pH。

（2）菌球直徑與菌球密度。采用移液槍，隨機吸取一定體積培養液，將培養液中菌球排列成直線，測總長度，取平均值，得菌球直徑（mm/個）；對培養液中的菌球計數，得菌球密度（個/mL）。

（3）菌球體積及菌絲體生物量。用清水充分沖洗經紗布過濾的菌球，倒入量筒靜置3 min后，測定菌球體積，隨后將菌球于50 ℃烘干至恒重，電子天平稱重。

（4）培養液還原糖含量。培養液經8 000 r/min離心10 min后，采用3,5-二硝基水楊酸法測定培養液還原糖含量。

（5）菌絲生長速度與菌落白度。將采用繡球菌工廠化栽培配方[12]的培養料裝入培養皿中，每培養皿15 g，高壓滅菌，冷卻后備用。從液體菌種內

隨機挑取不同培養時間的菌球，接種至培養皿中，24～25 ℃恒溫避光培養，待菌絲長滿培養皿時，測定菌落直徑，計算菌絲生長速度（mm/d）。同時采用色差儀（Konica Minolta CR410）測定菌落顏色，以白色色卡（X=84.99，Y=87.00，Z=96.70）為對照，測定結果（ΔE*ab）越小，說明菌落顏色與白色色卡相差越小，菌落越白。

2 結果與分析

2.1 液體菌種培養條件優化

（1）初始pH。培養結束時，培養基pH降低至3.37～3.88。當初始pH為5.5時，菌球密度最大，為55.5±5.0個/mL，但與其他處理無顯著性差異。當培養基初始pH為5.0時，菌絲體生物量最大，為8.5±0.78 g/L，差異顯著（圖1）。

圖1 培養基初始pH對繡球菌液體培養效果的影響

（2）裝液量。裝液量80 mL時，菌球密度最大，為91.5±5.0 個/mL，但此時的菌絲體生物量最低，僅為6.5±0.4 g/L；繼續增加裝液量，菌球密度顯著降低，菌絲體生物量與菌球直徑均顯著增大。裝液量為170 mL時，菌絲體生物量最大，為9.5±0.6 g/L（圖2）。綜合考慮菌球直徑、菌球密度及菌絲體生物量，適宜的裝液量應為140～170 mL。

（3）接種量。隨著接種量增大，菌球密度先升高、后降低，差異不顯著。接種量在3%～9%之間，菌絲體生物量顯著提高，9%時達最高，為4.2±0.4 g/L；繼續增大接種量，菌絲體生物量基本維持不變，無顯著性差異（圖3）。

圖2 裝液量對繡球菌液體培養效果的影響

圖3 接種量對繡球菌液體培養效果的影響

（4）搖床轉速。在搖床轉速120～210 r/min范圍內，隨轉速增大，菌球密度逐漸升高，菌絲體生物量逐漸降低，差異不顯著（圖4）。

圖4 搖床轉速對液體培養效果的影響

經綜合分析，得出液體菌種適宜培養條件為：培養基初始pH 5.0，裝液量140～170 mL，接種量9%，轉速120～150 r/min。

2.2 液體菌種培養終點的確定

（1）培養基pH及菌球直徑。隨培養時間延長，培養基pH呈下降趨勢。培養前期（0～6天），pH基本保持穩定，隨后迅速下降至3.88，此后降幅放緩，說明從第6天開始，菌絲已逐漸適應新的培養基，酸性代謝物質開始逐漸積累。接種第0～8天，勻漿后的菌絲逐漸恢復生長，個別生長較快的菌絲已成小菌球；從第8天至培養結束，菌球直徑基本維持在1.1 mm左右（圖5）。

圖5 不同培養時間的培養基pH及菌球直徑

（2）不同培養時間的菌球密度及菌球體積。菌球密度可在一定程度上反映接種后菌絲萌發點。從第8天開始，菌球密度逐漸增大，至第16天達到最大，隨后基本維持穩定（圖6）。

圖6 不同培養時間的菌球密度及體積

菌球體積在培養過程中整體呈下降趨勢，其中第6～14天下降明顯，之后基本保持穩定。培養初期，由于菌球表面蓬松呈絨毛狀，單位時間內沉降速度慢，因此在培養基中所占體積較大，隨著培養時間延長，菌球表面絨毛逐漸消失，體積減小。采用體視顯微鏡對不同培養時間的菌球進行觀察，結果也證實了這一點（圖7）。

圖7 液體菌種培養過程中菌球形態變化

（3）菌絲體生物量及培養基還原糖含量。在繡球菌液體菌種培養過程中，菌絲體生物量呈上升趨勢（圖8）：第0～8天，變化不明顯；8～16天期間，迅速增加，差異顯著（<0.05）；16天以后，增長趨勢減緩；第20天時達到最大（3.9±0.26 g/L）。

繡球菌液體菌種培養初期，菌球處于遲滯期，還原糖含量下降不明顯，從第10天開始，逐漸降低；隨菌球生長加快，16天后顯著下降（<0.05）（圖8）。

圖8 不同菌齡的菌絲體生物量及培養液還原糖含量

（4）菌絲生長速度及菌落白度。繡球菌液體菌種培養至第8天接種，菌絲生長速度最快；隨后

逐漸減慢，但無顯著性差異（>0.05）；12天之后接種，生長速度顯著下降（<0.05）（圖9）。

菌落白度以液體菌種培養6～12天接種的較高，結合菌絲生長速度，說明該菌齡菌種菌球活力強（圖9，圖10）。菌齡12天以上的，隨培養時間延長，菌球活力下降，接種后的菌落白度顯著降低。

3 結論與問題討論

液體菌種具有生產成本低、培養周期短、品質好等優點，是食用菌產業發展的必然趨勢[13]。前期研究結果[11]表明：采用常規液體培養方法，培養第6天時菌球直徑最小（1.20 mm），但此時菌球密度較低（9.56 個/mL）；隨培養時間延長，菌球密度最高也僅52.3個/mL，作為菌種使用，接種后菌絲萌發點仍然偏少。對菌種進行勻漿可有效增加菌球密度，且接種后菌絲生長速度快、產量高且穩定，這在金針菇、杏鮑菇、真姬菇中已有報道[14, 15]。為使勻漿前獲得較高的菌絲生物量，本試驗對繡球菌液體菌種培養條件予以優化。

圖9 不同菌齡液體菌種接種后菌絲生長速度及菌落白度

圖10 不同菌齡液體菌種接種后的菌絲生長情況

刁文濤等研究認為，繡球菌液體菌種發酵培養基最佳pH為3.5[16]，楊麗莉[17]與陳博文等[10]則認為最適pH在4～5。本試驗結果與以上結果類似：當液體培養基初始pH為5.5時，菌球密度最高，但pH為4.0時菌絲體生物量最大（5.45±0.07 g/L）。

以250 mL三角瓶進行液體培養，劉成榮等[18]認為適宜的裝液量為150 mL，楊麗莉[17]則認為裝液量為110 mL時，菌絲生物量最大（5 g/L）。本試驗得出的適宜裝液量為170 mL，與已有研究結果有較大差異。原因可能是培養基配方不同使培養基滲透壓存在差異，進而影響培養基溶解氧含量和菌絲生長速度。

搖床轉速主要影響培養基剪切力和溶解氧含量，高轉速有利于菌球增多。本試驗結果驗證了這一點，當搖床轉速為210 r/min時，菌球密度可達78.0±8.5個/mL。已有研究結果顯示，搖床轉速在110～200 r/min之間時，菌絲生物量呈現先增加后降低的變化趨勢[17, 18]。但本試驗在120～210 r/min范圍內，菌絲生物量隨轉速增大呈降低趨勢。

繡球菌適宜在偏酸性條件下生長，液體培養條件與金針菇[19, 20]、杏鮑菇[21]、真姬菇[22, 23]、靈芝[24]，江西蟲草[25]等類似。繡球菌液體菌種培養6天后，培養液pH顯著下降，至第10天降至3.89，此后下降趨勢變緩。說明第6～10天，菌絲生長旺盛，酸性代謝物開始積累，這從菌球直徑和菌球密度的變化上也能看出。

食用菌菌絲生物量可在一定程度上作為培養終點的判斷指標，如真姬菇[23]、金針菇[26]、杏鮑菇[27]、草菇[28]等液體菌種培養。本試驗結果顯示，繡球菌液體菌種培養當菌絲體生物量達到最大時，菌絲的生長速度和菌落白度卻顯著（<0.05）降低，說明此時菌球活力已經下降。因此，要獲得活力強的液體菌種，就須將培養終點提前。

綜合考慮菌絲體生物量與菌球活力，宜選擇接種后9～10天作為液體菌種培養終點，此時菌球直徑1.07±0.03 mm/個，菌球密度111±11.53 個/mL，接種后菌絲生長速度2.34±0.18 mm/d。

本研究結果獲得的繡球菌液體菌種菌球密度大、直徑小、活力強，可為液體菌種應用于繡球菌工廠化栽培提供重要參考，并可為繡球菌液體菌種的質量控制提供借鑒。

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Optimization of culture conditions of liquid spawn of

Ma Lu Yang Chi Xiao Donglai Ying Zhenghe Jiang Xiaoling Liu Xiaoyu Lin Yanquan*

(Institute of Edible Fungi, Fujian Academy of Agricultural Sciences, National and Local Joint Engineering Research Center for Breeding & Cultivation of Featured Edible Fungi, Fuzhou, Fujian 350014, China)

Liquid spawn could reduce the spawn running time and allows the antomation of inoculaton, which is crucial for industrial large scale production. In order to obtain liquid spawn ofwith high density, small diameter and more vigorous mycelium pellet, the culture conditions and its terminal points were optimized. The optimal culture conditions for maximum biomass production were listed as follows: initial medium pH 4.0, liquid volume 140～170 mL, inoculation volume 9% and rotation speed 120～150 r/min. The terminal point of liquid spawn culture is 9～10 days after inoculation, under this conditon, pellet diameter is 1.07±0.03 mm, pellet density is 111±11.53 pellets/mL and mycelial growth rate is 2.34±0.18 mm/d. the results obtained in this work will be beneficial for commercial cultivation of.

liquid culture; culture conditions; terminal point of cultivation; mycelial activity

S646

B

2095-0934（2020）06-428-06

福建省屬公益類科研院所基本科研專項（2018R1020-4、2018R1020-3）；福建省農業科學院科技創新團隊項目（STIT2017-1-6）；福建省科技特派員后補助項目繡球菌工廠化栽培技術及產業化平臺建設

馬璐（1984—），男，碩士，主要研究方向為食藥用菌工廠化栽培。E-mail：malujj@163.com。

林衍銓（1963—），男，研究員，主要從事食用菌育種與工廠化栽培的研究與開發，E-mail：lyq-406@163.com。