蒙藥制劑烏力吉-18微生物限度檢查方法適用性試驗

杜美娜 劉建明 劉楊

摘要：目的：建立蒙藥制劑烏力吉-18的微生物限度檢驗方法。方法：按《中國藥典》2015年版四部非無菌產品微生物限度檢查法：控制菌檢查法進行適用性試驗。結果：供試品5種試驗菌回收比在0.5～2之間，控制菌均能正常檢出。

關鍵詞：烏力吉-18;微生物限度;適用性試驗

本文參考相關文獻，根據蒙藥制劑中成分的抑菌作用強度不同，采用了平皿法建立烏力吉-18相應的微生物限度檢查方法，經方法適用性試驗證實該方法簡易有效。

一、實驗材料

1.樣品名稱

烏力吉-18，批號：20180502、20181018、20190410，具由新疆維吾爾自治區(qū)博爾塔拉蒙古自治州蒙醫(yī)醫(yī)院生產。

2.菌種

枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]、沙門氏菌[CMCC（B）50094]以上培養(yǎng)基和菌種均由中國食品藥品檢定研究院提供工作菌株為第3代。

二、菌液及供試液制備

1.菌液制備

取經35℃培養(yǎng)18-24小時的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數不大于10000cfu/ml的菌懸液;取經35℃培養(yǎng)18-24小時的大腸艾希氏菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數不大于100cfu/ml的菌懸液;取經25℃培養(yǎng)2-3天的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數不大于10000cfu/ml的菌懸液;取經25℃培養(yǎng)5-7天黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數不大于10000cfu/ml的孢子懸液。

2.供試液制備

取樣品10g，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，制成1：10的供試液;取1：10的供試液10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至50ml，制成1：50的供試液。

三、需氧菌總數和霉菌及酵母菌總數計數檢查方法適用性

供試液分別加入上述5種代表性實驗菌株，再加15-20ml規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24-72小時，觀察結果，平板計數，測定回收比值。

試驗組：取上述1：10供試液10ml加入0.1ml試驗菌，混勻，取含菌供試液1ml分別注入無菌平皿中，立即相應的瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。需氧菌總數計數的試驗菌株為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌，相應的瓊脂培養(yǎng)基為胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基;霉菌和酵母菌總數計數的試驗菌株為沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。供試品對照組：取制備好的供試液，不加菌液，按試驗組計數方法，測定供試品本底菌數。菌液對照組：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行測定其菌數。結果如下：

四、控制菌檢查方法適用性

1.適用性試驗

大腸艾希氏菌，取1：10的供試液10ml，加入大腸埃希菌菌液1ml，加入100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，混勻，置35℃培養(yǎng)18小時，取上述培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)24小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上35℃培養(yǎng)18小時，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基應能檢出大腸艾希氏菌反應特征。

耐膽鹽革蘭陰性菌，取樣品1：10供試液100ml，置25℃培養(yǎng)2小時，取上述培養(yǎng)物10ml，加大腸埃希菌菌液、銅綠假單胞菌菌液各1ml，搖勻，接種至100ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24小時后，分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)18小時，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上應能檢出耐膽鹽革蘭陰性菌的反應特征。

沙門氏菌，取供試品10g，加入200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，沙門氏菌菌液1ml混勻，35℃培養(yǎng)24小時。取的上述培養(yǎng)物1ml，接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基中。35℃培養(yǎng)18小時，取少量RV沙門氏菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，35℃培養(yǎng)18小時，木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上應能檢出沙門氏菌的反應特征。

2.上述結果表明

本品的控制菌檢查方法為：大腸艾希氏菌，取樣品1：10供試液10ml接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基用量100ml;耐膽鹽革蘭陰性菌，取25℃培養(yǎng)2小時樣品1：10供試液10ml，接種至腸道菌增菌液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基用量100ml。

五、結論

按《中國藥典》2015年版四部微生物限度檢查法、控制菌檢查法進行三次獨立適用性試驗，5種試驗菌回收比在0.5～2之間，控制菌均能正常檢出。

參考文獻：

[1]中國藥典通則四部[M].北京：醫(yī)藥衛(wèi)生出版社.

[2]蒙藥烏力吉-18丸的藥理與臨床研究概況[J].內蒙古民族大學學報（自然科學版）.

課題名稱：論文來自課題《博州蒙藥制劑微生物限度檢驗方法的研究》