水稻花粉外壁孢粉素合成及運輸相關基因研究進展

王聯紅 張秋云 劉家林 沈亞琦 歐陽林娟 賀浩華 胡麗芳

（1. 江西農業大學農學院，南昌 330045；2. 作物生理生態與遺傳育種教育部重點實驗室，南昌 330045）

水稻是重要的糧食作物，其產量與糧食安全息息相關［1］。花藥作為重要的生殖器官，探討水稻花藥發育的分子機制對雄性不育系的培育及育種利用有重大意義［1］。花藥中的花粉壁能保護雄配子免受各種環境脅迫和病原體攻擊，在花藥的正常發育中起著不可或缺的作用［2］。花粉外壁（Exine）作為花粉壁的外層結構，在花粉壁的形成中起關鍵作用，其主要成分是孢粉素［3］。孢粉素合成和運輸過程十分復雜，涉及多種調控因子共同作用［1］，探究相關基因的分子作用機制具有重要的理論和實踐意義，歷來受研究者所關注。

1 花粉外壁和孢粉素

花粉外壁作為圍繞花粉粒的復雜多層外表面，對雄性生殖發育至關重要，在花粉粒的正常發育及抵抗逆境等方面扮演著重要角色［3］。花粉外壁由外壁外層（Sexine）和外壁內層（Nexine）組成。外壁外層又包括邊緣的頂蓋層（Tectum）和內部徑向的柱狀層（Bacula）［3］。花粉外壁形成包括3個步驟：（1）減數分裂階段形成胼胝質；（2）四分體階段通過孢粉素前體生物合成來形成初生外壁；（3）小孢子發育階段前完成孢粉素前體的沉積和聚合［1，3］。孢粉素是花粉外壁的主要成分，可包裹和保護花粉粒，在陸地植物進化中扮演重要角色［4］。研究表明，它是一種具有抗性的化合物，可對抗長期干旱和各種化學侵蝕，因而被認為是自然界中最堅韌、最耐用的材料之一。

孢粉素的聚合建立包括合成和運輸兩個重要步驟［4］。孢粉素的合成是指孢粉素前體的合成與分泌，孢粉素的運輸是指孢粉素最終運輸至小孢子，并在小孢子上合成精細外壁結構的過程。孢粉素的合成運輸過程中包含了3個重要階段［5］：（1）孢粉素前體的從頭合成，該過程的調控因子主要包括酰基輔酶A合成酶、聚酮合成酶、四肽a-吡咯酮還原酶及細胞色素P450（CYP450）家族蛋白等［5］。（2）從脂質雙分子層到質外體的大量分泌，該過程的調控因子主要包括膜結合蛋白，如轉運蛋白、受體或通道蛋白，質膜定位的ATP結合盒（ABC）轉運蛋白，這些調控因子對脂質底物大量運輸不可或缺［5］。（3）脂質蛋白的轉運，該過程主要為編碼脂質轉運蛋白（LTP）家族的基因［5］，其主要為孢粉素前體從絨氈層細胞傳遞到花粉外壁上提供大量的候選底物。

通過遺傳學和分子生物學的相關方法對孢粉素合成及運輸過程進行研究，目前已鑒定出了一系列與之相關的基因，這為進一步研究水稻花粉外壁的形成機制提供了理論線索。

2 水稻孢粉素合成相關基因

目前已鑒定出14個與水稻孢粉素合成相關的基 因，如CYP703A3、CYP704B2、GAMYB、DPW、DPW2、HTH1、OsACOS12、OsCER1、OsCER1、OsNP1、OsPKS1、OsPKS2、OsTKPR1和Wda1等，主要編碼酰基輔酶A合成酶、聚酮合成酶、四肽a-吡咯酮還原酶、細胞色素P450（CYP450）家族蛋白及GMC氧化還原酶等（表1）。

細胞色素P450（CYP450）家族成員CYP703A3和CYP704B2分別參與了脂肪酸的鏈內和ω-羥基化途徑［6-7］。CYP703A3可催化花粉外壁形成所需的C10至C14脂肪酸的鏈內羥基化［6］，該基因突變可引起花粉外壁和花藥表皮層缺陷。CYP704B2催化C16至C18的v-羥基化脂肪酸的產生［7］，該基因突變會導致絨氈層發育異常，花粉外壁及花藥角質層缺陷［6-7］。CYP703A3的缺失會阻斷高等植物雄性器官發育所需月桂酸的鏈羥基化反應，而CYP704B2的缺失則阻斷了脂肪酸的β-羥基化反應，二者的缺失都會進一步阻斷了孢粉素脂肪類反應底物的合成，從而擾亂了花粉外壁和花藥角質層的發育［7］。GAMYB編碼一種R2R3MYB轉錄因子，其主要通過直接影響CYP703A3的表達水平來影響孢粉素前體的合成［8］。

DPW（Defective Pollen Wall）編碼一種新型的脂肪酰基載體蛋白還原酶，對花粉孢粉素生物合成前體初級脂肪醇的合成非常重要［9］，該基因突變導致花粉外壁缺陷，烏氏體異常。DPW系統發育及功能分析表明其參與的脂肪醇生物合成途徑是孢粉素前體合成的關鍵。DPW2（Defective Pollen Wall 2）編碼一種催化ω-羥基脂肪酸轉化為羥基肉桂輔酶A的BAHD酰基轉移酶［10］，該基因的功能喪失表現出與DPW類似的花粉外壁內層II（Nexine II）和花粉內壁（Intine）缺失的表型。進一步化學分析表明突變體中芳香酸（肉桂酸和阿魏酸）和v-羥基化脂肪酸的角質單體增加［9］，表明DPW2的功能喪失很可能會破壞孢粉素的聚合。

OsACOS12、OsPKS1、OsPKS2和OsTKPR1都參與了苯丙烷代謝途徑，這些基因中的任何一個發生突變都會顯著影響水稻的雄性生殖能力［11-14］。OsACOS12編碼酰基輔酶A合成酶，參與孢粉素前體所需的脂酰輔酶A合成［11］，影響水稻絨氈層PCD和花藥角質層的形成；OsPKS1和OsPKS2編碼聚酮化合物合成酶（PKS），都影響了孢粉素前體生物合成途徑，阻礙了孢粉素的累積，影響了花粉外壁形成［12-13］。OsTKPR1屬于TKPR家族蛋白，催化PKS產生的四酮羰基還原為仲醇，在孢粉素形成 中 起 作 用［14］。OsACOS12、OsPKS1、OsPKS2和OsTKPR1基因突變會導致植株完全或部分雄性不育，其在擬南芥中的同源基因ACOS5、PKSA、PKSB和TKPR1突變同樣導致植株部分或完全不育，這表明ACOS12-PKS1/2-TKPR1孢粉素代謝物在水稻中是保守的［12-13］。

表1 水稻孢粉素合成相關基因

Wda1編碼一個富含組氨酸基序的蛋白質，該基因突變導致了花粉外壁形成缺陷，小孢子發育嚴重延遲并最終被破壞［15］。在突變體花藥中烯烴、脂肪酸和伯醇嚴重減少，表明了其在超長鏈脂肪酸（VLCFAs）中起作用。OsCER1是擬南芥中參與角質層蠟質生物合成的CER1的同源基因，該基因突變導致水稻絨氈層PCD延遲和質體發育異常，成熟花粉粒內的淀粉較少。WDA1與OsCER1通過參與VLCFAs的生物合成來影響孢粉素前體形成［16］，盡管Wda1與OsCER1具有較高的同源性，然而在OsCER1表達量降低的植株中qRT-PCR發現WDA1只在花藥發育第7階段表達顯著增加，而在其他花藥發育階段沒有觀察到明顯的變化，表明OsCER1可能參與除WDA1以外的不同途徑來影響孢粉素合成。

OsNP1和HTH1都編碼葡萄糖-甲醇-膽堿（GMC）氧化還原酶。OsNP1催化脂肪醇氧化成相應醛，參與聚合或組裝孢粉素前體所需的脂質分子的產生，OsNP1突變導致花藥變小，角質層缺陷且外壁形成不規則［17］。HTH1可作為鄰羥基脂肪酸脫氫酶起作用，催化長鏈鄰羥基脂肪酸向長鏈α-，鄰二羧酸脂肪酸的氧化，該基因突變導致花粉育性和活力顯著降低，突變體花藥壁塌陷和角質層較薄。鑒于HTH1的最適底物為C18脂肪酸［18］，其功能類似于CYP704B2在角質生物合成中的功能在孢粉素前體物質的合成中起作用。

OsGPAT3編碼一個保守的甘油-3-磷酸酰基轉移酶，該基因突變導致花粉外壁扭曲，花粉內壁缺失［19］。通過分析突變體中與孢粉素前體合成相關基因的表達水平，發現CYP704B2、CYP703A3、OsACOS12、DPW、DPW2、WDA1和OsNP1等7個基因的表達水平都顯著降低［19］，推測OsGPAT3可能通過直接或間接影響孢粉素合成代謝基因來確保孢粉素前體的順利合成。

3 水稻孢粉素運輸相關基因

目前已鑒定出8個與水稻孢粉素運輸相關的 基 因，包 括DPW3、OsABCG15、OsABCG26、OsABCG3、OsC6/Osg6B、OsEMF2b、OsLecRK-S.7和PTC1等，主要編碼ATP結合盒（ABC）轉運蛋白、脂質轉運蛋白（LTP）和PHD-finger蛋白（表2）。

表2 水稻孢粉素運輸相關基因

ATP結合盒轉運蛋白利用ATP衍生的能量，在細胞膜上運輸大量的脂質分子［20］。OsABCG3基因突變導致絨氈層異常降解，花粉缺乏花粉內壁和外壁內層II。除OsABCG3外，其他兩個ABCG家族成員OsABCG15和OsABCG26也在水稻花粉發育和雄性育性中所必需的［20-21］，其中任一基因的功能喪失都會導致完全雄性不育。OsABCG26主要協同孢粉素前體從絨氈層細胞向花藥壁運輸，而OsABCG15主要協同孢粉素前體從絨氈層細胞向花藥室運輸，OsABCG3尚不清楚其具體功能。OsABCG3、OsABCG15和OsABCG26都優先在花藥中表達，相關表達分析發現，OsABCG3的突變不會影響OsABCG15和OsABCG26的 表 達，OsABCG15的突變也不影響OsABCG3的表達，但OsABCG26的突變會影響OsABCG3的表達［21］，推測OsABCG3和OsABCG15可能參與到不同的代謝途徑中，而OsABCG26和OsABCG3可能處于同一代謝途徑中，通過相互的反應底物的反饋調節關系來協同調節水稻的雄性生殖發育［22］。

PTC1編碼PHD-finger蛋白，該基因突變導致植株花藥微黃且小，花粉外壁形成缺陷［23］。PTC1作為轉錄因子會通過調節下游靶向基因一起作用，研究表明參與孢粉素前體的生物合成和轉運的基因都是PTC1的潛在目標［23］。

OsEMF2b編碼一種核心的PcG（Polycomb Group）蛋白，可促進水稻組蛋白H3的第27個氨基酸上三甲基化（H3K27me3）的沉積，該基因突變表現為花藥壁缺陷和花粉發育異常。OsEMF2b和PTC1還可通過組蛋白甲基化修飾在花藥和小孢子發育中共同發揮作用，調節水稻花粉外壁形成［24］。

OsLecRK-S.7編碼一種新的定位于質膜的豆莢凝集素受體激酶，會啟動近膜區的磷酸化傳譯，在花粉發育中起關鍵作用［25］。該基因突變會引起花粉外壁和萌發孔形成出現缺陷，導致階段性質膜的不穩定和花粉細胞的死亡。通過基因表達分析發現，與孢粉素合成運輸相關基因的表達水平包括OsCYP703A3、DPW、OsCYP704B2、OsPKS1、OsPKS2、DPW2、OsACOS12、OsC6、OsABCG15和OsABCG26在突變體中顯著升高，推測突變體中花粉外壁增厚可能與孢粉素合成和運輸相關基因高表達有關，但其存在的級聯調節機制尚不清楚［25］。

DPW3編碼一種在陸地植物中保存的與膜相關的整合素蛋白。DPW3對孢粉素的運輸會產生顯著影響，基因突變會導致花藥角質層不平衡、胼胝質沉積中斷以及小孢子質膜波動異常［26-27］。

OsC6編碼一種攜帶脂質分子進入細胞外空間的脂質轉運蛋白［28］。OsC6可將脂質前體從絨氈層轉移到花藥室，在孢粉素轉運中起關鍵作用，該基因突變會導致烏氏體缺陷和花粉外壁發育不良。OsC6同時還受另一個參與孢粉素代謝基因GAMYB的調節，在gamyb突變體中OsC6的表達水平顯著降低，GAMYB可能通過控制OsC6的表達來共同調控孢粉素的運輸。

4 總結與展望

圖1 水稻孢粉素合成及運輸相關基因模式圖

通過歸納分析水稻花粉外壁中孢粉素合成及運輸相關基因可以發現，孢粉素的合成需要多種脂肪化合物的生物合成，特別是超長鏈羥基化脂肪酸，其可能是構建孢粉素的關鍵前體［2，29］。基因表達數據分析表明，至少有數百個基因在水稻孢粉素合成運輸中具有推定功能，這些基因的表達對如何協調孢粉素合成運輸以及花粉外壁的后續發育尚未得到很好的研究。

進一步的分析表明，某些基因間還存在著一定的級聯調控關系來控制孢粉素合成運輸（圖1）。PTC1和OsEMF2b在GAMYB的下游，GAMYB可正向調控OsC6、CYP704B2和CYP703A3，而OsEMF2b基因的上調可導致包括GAMYB在內的14個基因的表達上調及PTC1表達下調，表明OsEMF2b編碼的多梳蛋白家族對孢粉素運輸可能具有重要意義［30］。基因OsGPAT3表達量的降低會導致CYP704B2、CYP703A3、OsACOS12、DPW、DPW2、WDA1和OsNP1表達量顯著降低，而GAMYB的表達量顯著上升，表明OsGPAT3可能通過調節GAMYB的表達進一步調節其他孢粉素合成相關基因的表達，而PTC1可能參與其他平行的調節途徑。但目前關于OsGPAT3在水稻絨氈層發育中的功能網絡仍不清楚，未來的研究需要通過對已知的孢粉素代謝相關突變體中的基因表達模式進行分析，并進一步通過遺傳學和分子生物學的方法來確定其潛在的上下游調節因 子［31-32］。ACOS12、CYP703A、CYP704B、PTC1是孢粉素合成運輸的必須酶，也是陸地植物中保存較好的家族，可繼續挖掘更深入的互作關系［33］。由于OsLecRK-S.7突變體中OsNP1的表達水平顯著降低，OsC6、OsABCG15及OsABCG26表達升高，猜測OsLecRK-S.7在OsNP1的下游，OsC6及ABC轉運蛋白基因的上游［34］，由于LecRLK蛋白在孢粉素合成運輸途徑中的具體作用機制尚不清楚，下一步可通過相關基因表達量的大數據分析來探究其級聯調控機制。

迄今為止，許多脂質介導的雄性不育相關的基因已被分離鑒定。比如兩個細胞色素P450家族基因：CYP704B2和CYP703A3，是羥基化脂肪酸的催化劑［35-36］。DPW作為脂肪酰基載體蛋白還原酶影響角質和蠟質的積累，DPW2作為脂肪酸酰基轉移酶影響脂質和酚類化合物的積累［37］。ABC轉運蛋白基因OsABCG3、OsABCG15和OsABCG26協同工作，但發揮其自身功能，運輸不同材料幫助花粉外壁形成［4，38］。脂質轉運蛋白基因OsC6分泌到花藥角質層、花藥室以及絨氈層和中間層之間的空間，用于花粉外壁形成［39］。另外，WDA1、OsNP1和OsPKS2還可以調節孢粉素的生物合成和沉積［1，40-41］。這些基因的功能喪失不僅導致孢粉素合成運輸受阻，而且還導致花藥角質層和花粉外壁缺失，從而導致植株不育。然而，我們對花粉壁中芳香脂質的了解相當有限［41］，譬如脂質結構域在孢粉素形成過程中如何與芳香結構域相互連接仍然未知。因此，將來需要使用更靈敏的技術來分析孢粉素成分，使其保持原有的化學特性，再使用一致的技術來鑒定各類孢粉素成分。此外，胼胝體壁是通過哪種細胞機制來協助孢粉素進行沉積的還不清楚，今后需要更多涉及OsEMF2b羥基化步驟的信息，了解其與調控孢粉素合成運輸關鍵基因之間的互作關系。隨著相關技術的迅速發展以及基因編輯技術廣泛應用，越來越多參與編碼花粉壁發育相關蛋白基因功能將被逐步闡明，這將為人們充分理解水稻花粉壁發育的調控機制奠定堅實基礎［21］。