滇牡丹種子實時熒光定量PCR分析中內參基因的篩選與驗證

潘沫晗 陸添權 田波

（1. 中國科學院西雙版納熱帶植物園 熱帶植物資源可持續利用重點實驗室，昆明 650223；2. 中國科學院大學，北京101408）

滇牡丹（Paeonia delavayi）屬芍藥科芍藥屬（Paeonia）牡丹組（Sect.MoutanDC.）植物，是中國西南地區特有的野生資源植物，是芍藥屬分布最南的一個牡丹類群［1］。作為一種民族藥材，其根皮入藥稱為丹皮，用于鎮痛、鎮靜、抗炎、退熱、止血、降糖，具有很好的藥用價值［2］。同時滇牡丹是油用牡丹新品種培育的重要種質資源，也是開發食用油的潛在木本油料植物資源之一。牡丹籽油作為一種多功能食用油，含有至少14種脂肪酸成分，包括油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸等，其中亞麻酸的含量極高［3］，油脂品質優良，營養豐富。目前，關于滇牡丹的研究主要集中在栽培學［4］、孢粉學［5］、病害防治［6］及遺傳多樣性［7-8］方面，關于滇牡丹的分子生物學研究的報道較少。目前將分子生物學技術應用于植物基因功能的研究較為普遍，而研究植物生長發育過程中關鍵基因的功能是開發利用這些基因的前提。功能基因表達量及表達模式是確定基因功能的重要指標，內參基因是檢測基因表達量的必要參照，在檢測目標基因表達水平變化中起到校正作用，篩選合適的內參基因是研究基因表達的關鍵，能夠減少實驗誤差，提高結果可靠性［9］。因此，篩選相對穩定的內參是研究基因表達分析的前提［10］。

實時熒光定量PCR技術具有準確性強、操作簡單、結果可靠且成本低廉的特點。目前已經被廣泛應用于分子生物學研究的多個領域。聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）自從被發現后［11］，就迅速成為科學研究的熱點，并被進一步應用于醫學研究。目前在植物學研究中的應用也越來越廣泛，常見于植物抗逆機理研究、病原菌的檢測、植物與微生物互作機理研究、植物抗病性檢測、信號轉導、環境對植物基因表達的影響等方面［12］，解決了許多植物病理學和植物育種中的熱點和焦點問題。大量文獻表明熒光定量PCR技術已應用于主要作物如缺素條件的水稻［13］，轉基因的玉米［14］、大豆［15］等，近年來在林木如杉木［16］和黃梁木［17］甚至中藥中如川續斷［18］、黃精［19］和穿心蓮［20］也都采用了實時熒光定量PCR技術展開相關研究。

在植物的熒光定量PCR實驗中，常用的內參基因主要包括肌動蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）、轉錄延伸因子基因（EF1α）及β微管蛋白基因（TUB）等，這些常用的內參基因或參與細胞的基本代謝，或是作為細胞的組成成分，根據實驗條件和材料的特點選擇相應合適的內參進行標準化是得到準確熒光定量分析結果的關鍵［21］。基于滇牡丹種子發育過程中的基因轉錄組數據并參考相關文獻，本研究選擇了8個看家基因（Housekeeping genes，HKGs）即GAPC、PEPC、CYC、ACT、EF2α、TUB、ACP1和RPL1作 為 候 選內參基因，選擇Ge Norm等3個程序評估了8個候選內參基因在滇牡丹不同發育時期的種子中熒光定量PCR檢測結果的穩定性，為檢測滇牡丹不同發育時期種子中功能基因的表達分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

采集于云南省玉溪市澄江縣梁王山（東經102°52'45"，北緯24°43'57"）野生分布的滇牡丹種子，牡丹開花后每隔15 d取一次樣，分別取開花后25、40、55、70和85 d的種子。將所取的滇牡丹種子樣品置于冷凍管中，放于液氮中速凍，凍存后備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 不同發育時期的滇牡丹種子樣品RNA提取采用TIANGEN公司的多糖多酚總RNA提取試劑盒（DP441），按照說明書進行操作。獲得樣品總RNA。

1.2.2 總RNA的檢測 獲得總RNA后，用1%的瓊脂糖電泳和紫外分光光度計檢測RNA樣品質量。測定總RNA的濃度和純度，A260/280≈2.0-2.1，A260/230≈2.0，電泳檢測結果顯示總RNA完整性較好，條帶清晰，無DNA和其他雜質污染，28S與18S條帶比值約為2∶1，適合用作進一步反應。然后將提取的RNA樣品置于-80℃儲藏備用。

1.2.3 反轉錄cDNA 樣品反轉錄采用TIANGEN公司的FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（KR118）試劑盒按說明書反轉錄合成cDNA第一鏈。反應體 系 如 下：總 反 應 體 系20 μL，5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，總RNA 1 μg，加RNA-free純水補足到20 μL。反應程序為42℃、15 min：95℃、3 min。反應的第一步為去除基因組并進行反轉錄反應，第二步進行了酶滅活，完成cDNA第一鏈的合成。將反轉錄產物即cDNA置于-20℃下保存，以備進行后續PCR反應。

1.2.4 內參基因的選擇和引物設計 根據滇牡丹種子全長轉錄組數據庫（未發表）選擇了GAPC、PEPC、CYC、ACT、EF2α、TUB、ACP1和RPL1共8個候選基因作為滇牡丹種子不同發育時期的內參基因。利用Primer Premier 5.0軟件進行特異性引物的設計，標準如下：引物Tm 55±5℃，堿基長度18-22 bp，GC含量介于40%-60%之間。擴增產物長度在200-300 bp之間。由擎科生物科技有限公司（昆明）負責合成，引物信息見表1、2。對設計的引物進行PCR擴增，通過凝膠電泳驗證其特異性。

表1 候選基因的名稱

表2 八個候選內參基因的引物序列

1.2.5 熒光定量PCR 本實驗采用QIAGEN 公司的QuantiNova SYBR Green PCR Kit試劑盒，在384孔板的LightCycler 384 System上進行點樣，在羅氏LightCycler480 II 實時熒光定量PCR儀器上設置參數，進行熒光定量PCR反應，每個樣品設置3個重復。反應體系為：總體系10 μL。包含上下游引物各1 μL，1 μL cDNA模板，5 μL 2× SYBR Green PCR Master Mix，1 μL QN ROX Reference Dye，1 μL RNase-free water。反應條件：預變性95℃、2 min；變性95℃、5 s；退火60℃、10 s，共40個循環。延伸階段收集熒光信號，反應結束后獲得溶解曲線。

1.2.6 數據分析 一般認為擴增效率E應介于90%-110%之間。采用GeNorm等3個軟件對候選內參基因的表達穩定性進行分析。首先計算ΔCt，根據公式E=2-ΔCt，將數據輸入Excel表格，導入分析軟件進行分析，獲得候選內參基因的表達值，判定出穩定表達的內參基因。

2 結果

2.1 RNA質量檢測

選擇開花后25、40、55、70、85 d的種子，利用TIANGEN公司的多糖多酚總RNA提取試劑盒（DP441）方法提取上述樣本的總RNA，并對獲得的RNA 的濃度和質量進行檢測，獲得的RNA條帶（圖1），質量完好可用做下一步反應。

圖1 滇牡丹總 RNA 樣品的電泳檢測結果

2.2 內參基因引物特異性驗證

為了保證熒光定量分析的準確性，本實驗用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和測序對8個候選內參基因的引物特異性進行驗證，結果顯示擴增產物段大小符合預計（圖2），無引物二聚體和非特異擴增片段。

圖2 滇牡丹8個候選內參基因PCR產物的電泳檢測結果

基因的表達豐度用Ct表示，對各基因的表達豐度進行統計發現（圖3），在滇牡丹種子不同發育時期，8個內參基因的表達水平存在一定變化，其中TUB基因的表達豐度相對較高，而CYC和EF2α內參基因的表達豐度較低。

圖3 八個內參基因在滇牡丹種子不同發育時期的Ct值變化

2.3 內參基因穩定性分析

為了篩選在種子不同發育時期均能穩定表達的內參基因，本實驗利用 GeNorm 和 Normfinder和BestKeeper軟件分別對開花后 25、40、55、70和85 d 的種子中的 8 個候選內參基因的穩定性進行了分析。

2.3.1 GeNorm 分析結果 GeNorm軟件用M 值評估各表達穩定性，分析結果顯示，8個候選內參基因在種子不同發育時期中M值有所差異，根據表達穩定性大小排序（M 值越小越穩定），由高到低依次為CYC/EF2（0.824）＞RPL1（1.087）＞PEPC（1.296）＞GAPC（1.545）＞TUB（1.625）＞ACP（1.801）＞ACT（1.958）（圖4）。

圖4 GeNorm 軟件分析滇牡丹種子不同發育時期內參基因的表達穩定值排序

GeNorm 軟件生成內參基因的配對變異數（Vn/n+1）柱形圖，可以根據柱形圖選擇的最適合內參基因數目。GeNorm軟件可以通過分析計算所得的配對差異值Vn/n+1來確定該實驗條件下所需內參基因的最適個數，以減少使用單一內參基因所引起的偏差和波動。選擇閾值為0.15，當Vn/n+1＞0.15，表明最適合的內參基因個數是n+1個；Vn/n+1＜0.15，表明最適合的內參基因有n 個。GeNorm柱形圖分析結果顯示當選擇 V2/3值（0.383）大于程序所推薦值 0.15（圖 5），最合適的內參組合基因數目是 3個。滇牡丹種子不同發育時期表達最穩定的基因組合是RPL1，EF2和CYC，最不穩定的基因是ACT。

圖5 GeNorm軟件分析確定滇牡丹種子不同發育時期的最適內參基因的數目

2.3.2 NormFinder 分析結果 Normfinder 是基于方差分析對內參基因的表達穩定性直接進行評價，通CYC和EF2α作為內參基因， 選擇滇牡丹種子中油脂合成途經相關基因(表5)，設計引物（表6），對其表達量進行RT-qPCR分析，結果表明，以不同基因作為內參，5個油脂合成途徑相關基因在RTqPCR分析中的表達趨勢基本一致，相對表達量結果相近（圖6）。

表5 關鍵基因的名稱

3 討論

目前，應用最為廣泛的基因表達分析手段是熒光定量PCR技術，但是 RNA 不完整、污染以及反轉錄效率低等因素常影響其準確性。因此，選用合適的內參基因是保證熒光定量PCR分析結果可靠性過程序計算獲得穩定值（Stability，S），穩定值越低代表基因的表達穩定性越高，但該軟件只能選擇一個合適的內參基因作標準。分析結果顯示，TUB內參基因最穩定，而ACT基因最不穩定（表 3）。該軟件的結果與 GeNorm得出的結果相比稍有不同，這可能與2種軟件的計算方法的差異有關。但關于ACT基因在8個基因中表達最不穩定的結果。兩個軟件的結果是一致的。

表3 NormFinder 軟件分析滇牡丹不同發育時期種子內參基因的表達穩定性

2.3.3 BestKeeper分析結果 BestKeeper軟件主要通過該程序計算可以獲得標準變異系數（SD）和變異相關系數（CV）以及每個基因之間產生配對的相關系數（r），以這3個參數來判斷內參基因的穩定性。判定原則為相關系數越大、標準偏差和變異系數越小，內參基因穩定性越好，反之，穩定性越差；其中 SD 值的默認閾值為 1.0，低于該值即認為表達穩定；當 SD＞1 時，則該內參基因表達不穩定。BestKeeper分析結果（表4）顯示只有CYC、EF2α基因的SD值小于1，根據r值排序，EF2α＞CYC，綜合結果發現EF2α和CYC基因表達最穩定，而ACT基因在8個內參基因中表達穩定性最差。2.4 候選目標基因RT-qPCR分析

以通過穩定性綜合評價得到的表現最穩定的的重要前提［22］。為挖掘適用于滇牡丹種子不同發育時期基因表達分析的內參基因，本研究以滇牡丹不同發育階段的種子為材料，選擇8個候選內參基因，利用 Genorm、Normfinder和BestKeeper 軟件分析了它們在滇牡丹成種子不同發育時期的表達穩定性。根據各軟件評價標準［23-25］，綜合3個軟件分析的結果，成功篩選出了符合要求的內參基因。3個軟件分析的結果表明，在種子的不同發育時期中能夠穩定表達的基因是CYC基因和EF2α基因，3個軟件分析結果都顯示ACT基因的穩定性較差，說明該基因不適合作為滇牡丹種子的內參基因。

表4 BestKeeper 軟件分析滇牡丹不同發育時期種子內參基因的表達穩定性

表6 五個關鍵基因的引物序列

圖6 滇牡丹種子中油脂合成相關基因的熒光定量PCR分析結果（分別以CYC和EF2α為參照）

肌動蛋白ACT基因是植物中被廣泛應用的內參基因。在“金魁”獼猴桃（Actinidia deliciosa）中表達最為穩定［26］，在不同發育時期的銀杏（Ginkgo biloba）雌株葉片中也是表達最穩定［27］，該結論同樣也在4種木本油料種子油茶（Camellia oleifera）、沙棘（Hippophae rhamnoides）、文冠果（Xanthoceras sorbifolia）和油用牡丹（Paeonia suffruticosa）中得到了驗證［28］，而在本實驗中ACT基因的表達極不穩定，這進一步驗證了同一內參基因在不同實驗材料中表達穩定性不一定相同的結論。

CYC基因（親環素），又稱環孢素A結合蛋白，也寫作CYP等，具有多種生物學活性，存在于細胞質和各個細胞器內。CYC基因在甜櫻桃的營養器官中是最適宜的內參基因［28］，在大豆種子發育過程中也是表達最穩定的［15］，這都與本研究的結果一致。而EF2α基因（Translation elongation factor 2），即翻譯延伸因子2，也寫作EF2，是編碼蛋白質合成過程中一類蛋白質因子的基因。因為表達量恒定，所以是熒光定量PCR中常用的內參基因之一。之前有關于蘿卜的研究發現，在不同品種、組織類型、光周期和春化處理及不同發育階段驗證8個候選內參基因表達穩定性時，EF2在不同的實驗條件下均能穩定表達［29］。本實驗中，EF2同樣在滇牡丹種子的不同發育時期穩定表達。

已有研究報道了牡丹組中不同物種基因表達分析的最適內參基因，王彥杰等［30］以牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）的不同組織（根、莖、葉和花瓣）為材料，利用熒光定量 PCR技術探討了5種常用看家基因的表達情況，認為各實驗條件下使用UBQ和GAPDH兩個表達最穩定的基因組合。評估牡丹的10個內參基因發現GAPDH和UBC被認為是在“鳳丹”（Paeonia ostii）和“西施”（Paeonia ostii）品種中最穩定的兩個參考基因［31］。張莞晨等［27］研究油用牡丹（Paeonia suffruticosa）種子的7個候選內參基因的穩定性，發現表達最穩定的基因是ACT。這些與本實驗獲得的結果有很大的差異，有可能是因為實驗所用的材料不同，說明滇牡丹與油用牡丹雖然同屬于芍藥屬植物，但二者之間存在一定的差異性。本研究以篩選到的表現最穩定的CYC和EF2α基因作為內參，對滇牡丹轉錄組測序數據中篩選到的油脂合成途徑中的部分相關基因表達量進行熒光定量PCR驗證，發現5個油脂合成相關的基因的熒光定量PCR結果的表達趨勢基本一致，表達量相近，表明本研究篩選出的內參基因可用作滇牡丹之間油脂合成相關基因表達分析的內參基因，也為牡丹組其他植物油脂合成相關基因表達量分析時內參基因的篩選提供了參考。

4 結論

本實驗通過3個軟件評估了8個傳統內參基因在滇牡丹種子中表達的穩定性，獲得了兩個最適合滇牡丹種子的內參基因CYC和EF2。