土壤微生物對異噁草酮連續施用的響應

張盈 吳小虎 李曉剛 段婷婷 徐軍 董豐收 劉新剛 鄭永權

（1. 貴州省農業科學院植物保護研究所，貴陽 550006；2. 中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室 農業農村部農產品質量安全生物性危害因子（植物源）控制重點實驗室，北京 100193；3. 湖南農業大學植物保護學院，長沙 410128）

異噁草酮、異惡唑啉酮類為選擇性苗前除草劑，因其具有除草譜廣、持效期長、適應性強等特點而被廣泛應用于防除大豆、水稻、甘蔗、油菜等田中的一年生雜草［1-2］。目前，我國已登記的異噁草酮產品50個，登記在大豆上的產品45個，是我國大豆田中除草劑使用較多的除草劑之一。然而，異噁草酮通常是土壤噴霧直接作用于土壤。而且，土壤中的異噁草酮降解緩慢，半衰期達10-137 d，殘存的異噁草酮刺激東北黑土中細菌和真菌的生長，抑制了多酚氧化酶活性［3］，對土壤微生物活性存在潛在風險。

土壤微生物是非常敏感的組分，在土壤中發揮著重要的生態系統功能。土壤中微生物群落是評價土壤生態系統穩定的重要指標［4］，能夠通過改變群落結構和功能等方式對環境變化作出響應。目前，異噁草酮對于土壤微生物的影響大多數集中室內培養條件下微生物種類、數量以及群落組成的影響［3，5-6］，如劉亞光等［3］研究結果表明異噁草酮（200 μg/kg、500 μg/kg和700 μg/kg）刺激東北黑土中細菌和真菌的生長，Tomco等［5］發現厭氧條件下異噁草酮降低了土壤中總PLFA含量，好氧條件下改變了放線菌的生長動態，Du等［6］研究發現80 mg/kg異噁草酮顯著降低粉砂質壤土和黑土中細菌α多樣性，改變群落結構以及影響了NO3--N濃度、固氮菌（nifH）及氨氧化細菌（AOB）基因拷貝數。

隨著生物信息技術的不斷發展，土壤微生物的相關研究由群落組成向微生物間的相互作用和功能轉變。微生物間的相互作用不僅決定微生物群落的復雜結構，而且深入影響群落功能執行［7-8］。馬壘發現砂姜黑土區長期施用磷肥提高了真菌網絡的復雜度，增強群落穩定性，增加對外界環境變化的“抵抗力”［9］。Mendes等［10］網絡分析發現抗性菜豆增強根際土壤微生物種群間關聯程度，降低病原菌對根部的侵染成功率。Gu等［11］利用FAPROTAX（Functional Annotation of Prokaryotic Taxa）預測了施用有機肥和化學肥料的茶園土壤細菌元素循環功能差異。因此，本文研究了異噁草酮對土壤細菌和真菌的影響，在此基礎上，構建土壤中的微生物群落分子生態網絡以及對細菌群落進行功能預測，解析異噁草酮脅迫下微生物網絡結構中的微生物間的互作關系以及N循環功能菌群的響應，為評價其對土壤生態環境效應提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

藥劑：異噁草酮原藥（96%），山東濰坊先達化工有限公司生產；作物：大豆（中黃13號）；土壤：河北省廊坊市安次區炊莊中國農業科學院廊坊科研中試驗基地（N39°30'55"，E116°36'52"）2年未進行任何農事操作和施藥的0-15 cm表層土壤，去除植物殘體和石塊等雜質、混勻，2 mm過篩備用；供試土壤特性：粉砂質壤土，pH為8.3，有機質含量13.7 g/kg，速效鉀含量134 mg/kg，有效磷含量41.5 mg/kg，和分別為3.61 mg/kg和60 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計 試驗于2017-2018年在中國農業科學院植物保護研究所的設施日光溫室內（N 40°2’2”，E106°17’33”）進行。試驗共設置2個處理：T1：1 200 g a.i./hm2，田間推薦劑量以及CK：空白對照，每個處理5個重復。在長575 mm×寬390 mm×高250 mm的塑料箱中裝入35 kg 供試土壤后均勻播種15粒大豆，于苗后1-2片復葉期噴施異噁草酮。2017年和2018年各噴施1次。第2次噴藥后第7、15、30、60、90天采集土樣，一份用于測定異噁草酮殘留量，一份用于提取DNA后進行細菌、真菌擴增子測序和qPCR絕對定量測定土壤細菌、真菌以及氮循環相關的功能菌群（固氮菌nifH、氨氧化細菌AOB和氨氧化古菌AOA）的拷貝數。

1.2.2 土壤中異噁草酮殘留量檢測 參照Du等［6］報 道 的QuEChERS提 取、UPLC-MS/MS（TQD，Waters）檢測土壤中異噁草酮濃度。土壤樣品經0.2%甲酸乙腈提取，離心后取上層清液過0.22 μm濾膜，超高效液相色譜分離，電噴霧電離、正離子掃描、三重四級桿串聯質譜以多反應監測模式下進行檢測，基質匹配標準品外標法定量分析。異噁草酮定量離子對為240.2＞125.1m/z。添加回收濃度為：0.1 mg/kg、0.5 mg/kg和5 mg/kg，每個濃度重復5次。

1.2.3 DNA的提取和qPCR檢測 土壤總DNA采用FastDNA? SPIN Kit for Soil試劑盒（mp biomedicals，Santa Ana，CA，USA）提取。每個樣本稱取0.5 g干重的鮮土，按照說明書操作提取DNA。以1.5%瓊脂凝膠電泳檢測DNA完整性，Nanodrop 2000測量其濃度和純度。

參照Du等［6］的方法中引物和擴增程序進行實時熒光定量PCR（Real-Time PCR，RT-PCR）測定細菌、真菌、氮循環功能菌群（nifH、AOA和AOB）拷貝數。標準曲線用10倍稀釋質粒制作，20 μL反應體系由10 μL iTaq Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），7 μL水，1 μL 10 μmol/L正反向引物和1 μL土壤DNA樣本。擴增效率為83.2-104.5，R2≥0.992 8。

1.2.4 細菌和真菌群落的擴增子測序 用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物對細菌16S rRNA V3-V4區進行PCR擴增［12］，特異性引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）［13］對真菌ITS1區進行PCR擴增，將純化后的擴增片段使用Illumina HiSeq 4000基因文庫在PE250的讀取長度下測序。相關測序工作由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質控，FLASH軟件進行拼接，UPARSE軟件（version 7.1 http：//drive5.com/uparse/）去除單序列和嵌合體后按照97%的相似度對序列進行OTU（Operational Taxonomic Units）聚類。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，16S比對Silva138/16S_bacteria數據庫，ITS對比unite8.0/its_fungi數據庫，設置比對閾值為70%。

1.2.5 數據分析 雙指數動力學模型Y=A×e（-k1×t）+B×e（-k2×t）（KinGUIIv2.1 巴斯夫作物有限公司）分析異噁草酮在土壤中的降解情況。處理組與對照組間細菌、真菌以及氮循環相關的功能菌群拷貝數采用SPSS 22.0進行t檢驗分析（P＜0.05，P＜0.01）。

細菌和真菌擴增子測序結果去除線粒體和葉綠素序列后按最小樣本序列數抽平，使用mothur（version v.1.30.1）分析計算樣品的Alpha多樣性值（Shannon指數和heip指數）。基于abund_jaccard算法、Canberra算法分別進行細菌和真菌群落進行主坐標分析（PCoA）分析，ANOSIM分析計算R值和P值。

為評估CK和T1土壤中微生物的互做情況，基于16S 和ITS擴增子測序數據進行分子生態學網絡分析（http：//ieg4.rccc.ou.edu/mena/login.cgi），構建分子生態網絡并計算特征參數。網絡拓撲結構由模塊內連通度（Zi）、模塊間連通度（Pi）來進行表述。通過外圍節點（Zi≤2.5，Pi≤0.62），模塊樞紐（Zi＞2.5，Pi≤0.62），聯絡者（Zi≤2.5，Pi＞0.62）、網絡樞紐（Zi＞2.5，Pi＞0.62）確定關鍵物種［14］。網絡圖用Cytoscape 3.7.1繪制。

FAPROTAX http：//www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/PiCrust.html注釋細菌OTU的N循環功能［15］。

2 結果

2.1 異噁草酮在土壤中的消解動態

由表1可知，異噁草酮在土壤中平均回收率為88%-102%，相對標準偏差（RSD）為1.9%-5.5%，方法的準確性和精密性均滿足農藥殘留檢測的要求［16］。根據SANTE/12628/2019以添加回收最低水平作為分析方法的定量限（LOQ），異噁草酮在土壤中的LOQ為0.1 mg/kg。

表1 異噁草酮在土壤中的回收率及相對標準偏差（n=5）

異噁草酮噴施2次后在土壤中殘留消解動態如表2所示。2次施藥后第1天平均殘留量為5.0 mg/kg，第30天消解率達到72.1%，第90天消解率達到90.7%。降解曲線符合雙指數動力學模型：Y=4.7843×e-0.04721t+0.5989×e-0.0014t，半衰期為17.4 d。

2.2 異噁草酮對土壤中總細菌含量和Alpha多樣性的影響

施用異噁草酮對土壤總細菌16S rDNA拷貝數、shannon、heip指數的影響見圖1。第2次施藥后第15天，T1中細菌拷貝數（5.04×109/g干土）比CK細菌拷貝數（6.67×109/g干土）降低了24.4%（P＜0.05）；30-90 d，T1與CK差異不顯著（P＞0.05）（圖1-A）。

表2 異噁草酮在粉砂質壤土中的殘留量測定

16S擴增子測序結果經過質量控制后得到3 693 084 條高質量有效序列（每個樣品47 553-97 541條），去除線粒體和葉綠素序列、按最小樣本序列數抽平后，每個樣本中獲得30 866條有效序列，測序結果覆蓋度≥96.03%，稀釋曲線呈現平滑狀態，表明測序結果良好。圖1-B-C所示，施藥后第15天，T1中細菌shannon指數和heip指數高于對照組（P＜0.05），第7、30、60、90天，T1和CK的細菌shannon指數和heip指數差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 異噁草酮對土壤總細菌含量和shannon、heip指數的影響

2.3 異噁草酮對土壤中總真菌含量和Alpha多樣性的影響

圖2-A所示，施藥后第15天和60天，與CK的真菌拷貝數（2.66×108/g干土和3.34×108/g干土）相比，T1中真菌拷貝數（1.49×108/g干土和1.31×108/g干土）分別降低了43.9%和60.8%（P＜0.05）。然而，第7、30、90天，T1和CK無明顯差異（P＞0.05）。

圖2 異噁草酮對土壤總真菌含量和shannon、heip指數的影響

ITS擴增子測序結果經過質量控制后得到4 113 350條高質量有效序列（每個樣品42 830-114 867條），按最小樣本序列數抽平后有41 531條有效序列，測序結果覆蓋度≥99.64%，稀釋曲線呈現平滑狀態。圖2-B-C所示，施藥后第15天和第90天，T1中真菌shannon指數和heip指數明顯低于對照組（P＜0.05），其它采樣時間無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 異噁草酮對細菌和真菌群落組成及Beta多樣性的影響

CK和T1組土壤細菌主要由變形菌門（Proteobacteria），酸桿菌門（Acidobacteria），放線菌門（Actinobacteria），綠彎菌門（Chloroflexi），芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）組成，在各個樣本中5種菌門的相對豐度之和是72.67%-82.64%。其余相對豐度大于1%的門有擬桿菌門（Bacteroidetes），Patescibacteria門，粘球菌門（Myxococcota），浮霉菌門（Planctomycetes），厚壁菌門（Firmicutes）（圖 3-A）。從門的水平上對不同處理土壤樣品中細菌群落的組成進行相似性聚類分析，T1和CK之間存在一定的差異（圖 3-A）。進一步運用abund_jaccard算法基于OTU水平對細菌群落進行PCoA分析，結果顯示T1和CK的群落組成在整個實驗期間都存在明顯差異（P= 0.004-0.008，R=0.6160-0.9600）（圖3-B-F）。

圖3 不同樣本中細菌門的相對豐度和基于OTU水平細菌群落PCoA圖

子囊菌門（Ascomycota）是真菌群落中的優勢菌門（圖4-A），在CK和T1處理組中的平均相對豐度分別72.24%-93.63%。其余大于1%的門是擔子菌門（Basidiomycota）、被孢菌門（Mortierellomycota）。子囊菌門、擔子菌門和被孢菌門的序列數之和占真菌總序列數的86.82%-99.66%。從門的水平上對樣本中真菌群落的組成進行相似性聚類分析，除第7天外，第15-90天T1和CK之間存在差異。運用Canberra算法基于OTU水平對細菌真菌群落進行PCoA分析，發現T1和CK的群落組成在整個實驗期間都有明顯的差異（P= 0.004-0.0110，R=0.416-0.720）（圖4-B-F）。

圖4 不同樣本中真菌門的相對豐度和基于OTU水平真菌群落PCoA圖

2.5 異噁草酮處理下土壤微生物群落的分子生態網絡分析

通過篩選并保留80%樣本中同時出現的OUT構建系統發育分子生態網絡，具體見圖5-A和表3。表3可得，經驗網絡的平均聚類系數和模塊性指數明顯高于相應的隨機網絡，說明本研究構建的網絡為小世界網絡［17］和模塊網絡［14］。T1中節點數、連接數、平均度以及平均路徑長度高于CK，這些指標的差異在一定程度暗示了噴施異噁草酮使土壤微生物網絡結構更復雜。

系統發育分子生態網絡按模塊團體歸因布局，去除網絡中小于5個節點的模塊。如圖5-A 所示，CK有12個模塊，T1有13個模塊，且T1中真菌OUT節點消失。圖5-B顯示，大部分節點（＞97%）屬于外圍節點；CK和T1中均無網絡樞紐。CK和T1中模塊樞紐和聯絡者顯著改變。網絡中有12個模塊樞紐，其中CK中有5個（OTU4502、OTU3456、OTU3739、OTU3639和OTU3738）；T1中7個（OTU3540、OTU3423、OTU3461、OTU3717、OTU2896、OTU 3725和OTU3507）。OTU3372、OTU3422和OTU3456屬于CK網絡中的聯絡者，OTU3350、OTU3604、OTU3672和OTU3720屬 于T1網絡中聯絡者。2種網絡中的模塊樞紐屬于真菌被孢霉門和細菌芽單胞菌門、酸桿菌門、放線菌門、變形菌門、綠彎菌門，聯絡者中是酸桿菌門、Patescibacteria門和變形菌門（表4）。

表3 T1和CK的網絡拓撲特性

2.6 異噁草酮對土壤N轉化功能微生物的影響

異噁草酮處理對固氮菌nifH、AOA、AOB基因拷貝數的影響見圖6。nifH、AOA、AOB基因拷貝數為3.96×107-3.19×108、7.05×106-2.53×108和2.15×106-1.78×107/g干土。對于nifH，施藥后第15天，nifH基因拷貝數增加了20.3%（P＜0.05）；其它采樣時間，T1和CK無明顯差異（P＞0.05）。對于AOB，施藥后第60天，AOB基因拷貝數降低了45.2%，第90天增加了72.4%（P＜0.05）；7-30天無顯著差異（P＞0.05）。對于AOA，施藥后7-90天，T1與CK 間無顯著差異（P＞0.05）。

FAPROTAX功能預測發現，第7天增加了固氮族群微生物，第15天降低了硝酸鹽反硝化、亞硝酸鹽反硝化、氧化亞氮反硝化、反硝化、亞硝酸鹽呼吸，第30天降低了反硝化作用，第60天降低了硝酸鹽氨化、亞硝酸鹽氨化、氧化亞氮反硝化、反硝化、亞硝酸鹽呼吸，第90天降低了反硝化，增加了固氮、硝酸鹽呼吸、氮呼吸（圖7）。

3 討論

本研究發現溫室條件下，土壤中異噁草酮降解呈現先快后慢的趨勢，前30 d降解率高達72.1%，后期降解18.6%。前期降解速率快可能是由于異噁草酮添加土壤后，有一部分處于自由溶解態或被弱吸附狀態，作為微生物生長的碳源；隨后的緩慢降解階段可能是由于不同的吸附位點或隨著時間的推移吸附量增加所致［18］。其它研究，如氟磺胺草醚、氟樂靈等除草劑在土壤中的降解動態也呈現同樣的趨勢［19-20］。

連續兩次施用異噁草酮后，第15天顯著抑制細菌含量，卻顯著增加其群落多樣性和均勻度，這表明不同的細菌種群對異噁草酮響應不同。而且，CK組存在4 413種OTU，施藥后OTU增長至4706種，進一步證明異噁草酮的處理，增加了某些細菌物種。其它培養時間，處理間細菌含量無顯著性變化。Du等［6］研究發現，室內培養條件下，0.8 mg/kg異噁草酮（推薦劑量）處理對土壤中細菌拷貝數和多樣性沒有顯著影響。這些結果表明異噁草酮推薦劑量下使用，對土壤總細菌僅存在短期影響。此外，施藥后第7天，真菌群落多樣性和均勻度顯著降低；第15-60天真菌含量呈現降低的趨勢；第90天，群落多樣性和均勻度再次降低。異噁草酮處理后，網絡中真菌OTU節點以及模塊樞紐消失，暗示了真菌對于異噁草酮更加敏感。其它研究也發現，其它化學農藥如氟磺胺草醚和氯氰菊酯也導致真菌生物量減少，表明真菌對于某些農藥的脅迫更敏感、更容易在脅迫下中毒［19，21］。

模塊樞紐和聯絡者被認為是生態網絡中的關鍵節點。分子生態網絡分析發現，CK與T1網絡中關鍵節點完全不同，這表明異噁草酮脅迫下，土壤中形成了新的關鍵微生物種群，以維護微生物群落與功能的穩定。異噁草酮脅迫下，酸桿菌門Blastocatellia綱菌群、新鞘氨醇桿菌Novosphingobium和Vicinamibacteraceae菌群，變形菌門根瘤菌目菌群成為新的模塊樞紐；變形菌門根瘤菌目Rhizobiales菌群、交替赤桿菌屬（Altererythrobacter）科菌群成為新的聯絡者。Blastocatellia綱菌群能適應不同pH環境，具有降解復雜的碳化合物的能力［22］。新鞘氨醇桿菌是代謝上的多功能種群，一些文獻報道具有一定的生物修復能力，可降解克百威和萘［23-24］。Vicinamibacteraceae科的一些成員能降解復雜的有機化合物，還可能有幾丁質的降解基因［25］。交替赤桿菌屬中一些種群能還原硝酸鹽［26］；根瘤菌目的一部分微生物能參與生物固氮。因此，這些新增的關鍵菌群可能在抵抗異噁草酮的壓力以及維持土壤固有的生態功能中起著重要的作用。

圖5 基于OTU和隨機矩陣理論分析的大豆土壤微生物系統發育分子生態網絡

表4 不同處理中的關鍵OTUs

圖6 異噁草酮對土壤中氮轉化功能菌群含量的影響

圖7 FAPROTAX對空白組和異噁草酮處理組大豆土壤細菌群落功能的預測（P＜0.05*，P＜0.01**）

此外，異噁草酮處理后，第15天增加了固氮菌基因含量，第60天降低了AOB基因含量，與功能預測的結果一致。異噁草酮還顯著降低了硝酸鹽反硝化、亞硝酸鹽反硝化、氧化亞氮反硝化等，表明異噁草酮可能抑制了反硝化過程。一些文獻報道外源物質的加入能抑制土壤的反硝化，如硅肥使用使水稻土壤的反硝化速率下降［27］，棉隆的使用降低了土壤中反硝化基因（napA、narG、nirK、nirS、qnorB）的拷貝數［28］。預測的這些細菌的潛在功能有助于明確異噁草酮對大豆土壤微生物生態系統功能的影響。異噁草酮的使用影響了土壤N循環功能，從而干擾了土壤生態的穩定性。

4 結論

研究顯示田間推薦劑量連續2次施用后，短暫降低了土壤細菌含量，且真菌敏感性高于細菌，微生物群落結構顯著改變，微生物間網絡結構趨向復雜，關鍵物種發生改變，土壤N循環中反硝化過程受到顯著影響。