酶聯免疫吸附試驗應注意的幾點事項

張慧瑛 寧德市蕉城區畜牧獸醫站 福建寧德 352100

酶聯免疫吸附試驗簡稱為ELISA，具有靈敏度高、特異性強、快速簡便、準確等優點。ELISA是基層獸醫實驗室最為常見的一種檢測技術，但該試驗對操作要求比較高，一些細節操作不當就會對試驗結果的準確性造成很大的影響。筆者以多年來從事基層獸醫實驗室檢測工作的經驗，就ELISA試驗中應注意的幾點事項作如下探討，以供同行參考。

1 試驗前的準備

1.1 樣品 ELISA試驗中使用較多的是血清樣品。在全血采集時，采血過程要求無菌，同時避免出現溶血現象。離心后的血清，短期可置于4℃保存；短時間內無法及時檢測的，應置于-20℃保存，避免反復凍融。

1.2 試劑 所有試劑、反應板在使用之前應恢復至室溫。回溫前，應先查看試劑盒是否在有效期內；此外，還需檢查試劑的狀態是否正常，如TMD底物是否已經顯色變質。使用過期或變質的試劑會影響檢測結果。

1.3 試驗操作 當前基層獸醫實驗室為了保證結果的準確性，所使用的試劑盒除了國產外，還有使用進口試劑盒。試劑品種較多，因生產廠家不同，從而操作方法不同；有的同一廠家同一病種不同批號的試劑盒，操作方法亦有不同。因此，試驗前一定要先熟悉步驟，避免因操作錯誤而導致試驗失敗，或因不熟悉步驟，操作時間過慢而影響試驗結果。

1.4 試劑配制 每個試劑盒對試劑的配制要求不同，有的需要配制樣品稀釋液，稀釋陰陽性血清、被檢樣品和洗液，有的只需要稀釋洗液，稀釋前檢查溶液是否有結晶析出，若有需用水浴鍋或恒溫培養箱融化，再根據說明書上要求的稀釋倍數進行稀釋，配制試劑應現配現用。

1.5 環境 試驗前應通過空調來調節實驗室溫度，保證在恒溫狀況下 （23～25℃）進行，并做好相關記錄。

2 試驗操作

2.1 加樣 加樣是ELISA試驗中操作最多的一個步驟。每次加樣前應充分混勻；使用多孔道移液器時，要注意每道的吸液量是否一致，如若不一致要進行調節；加樣應加在板孔底部，速度要均勻，不能打得過快，避免產生氣泡或飛濺至孔外；加不同樣品時要更換吸嘴，避免交叉污染；加樣的時間盡量縮短，尤其到顯色階段對時間要求較高；加樣過程中要專心，避免出現少加、多加、錯加、漏加、重復加等現象。

2.2 孵育 對環境條件進行控制。進口試劑盒對溫度的要求較低，只需室溫即可；國產試劑盒則要求37℃；此外，加底物溶液時需在暗室環境下進行；可利用培養箱、冰箱、濕盒等設備調節孵育溫度、濕度。反應板要求平放，若多個板一起孵育，切不可疊放，避免因受熱不均影響試驗結果。

2.3 洗板 洗板是ELISA操作中很重要的一步，雖不是反應步驟，但往往決定試驗的成敗。一般用300 μL洗液注滿每孔，洗滌3~5次，最后1次洗滌后進行拍干。洗板方式有兩種：一是基層最常用的人工洗板；二是使用洗板機洗板。人工洗板要求較高，與加洗滌液及甩板手法有關。檢測樣品數量多時可用洗板機洗板，使用前應對洗板機進行檢查、清洗，確保洗滌時不出現失誤。在洗板過程中，應避免液體濺出造成的反應孔交叉污染，洗板時間不宜過長，應避免反應孔底部包被結合物變干。

2.4 讀板 讀板前應提前預熱酶標儀半個小時，嚴格按操作說明進行波長設置。加完終止液后，應盡快放入酶標儀讀數，時間盡量控制在2 min以內。放入酶標儀讀數前，注意檢查反應板的朝向；同時，拿反應板的過程中應輕拿輕放，避免反應孔中的液體飛濺出來，既影響試驗結果，又污染酶標儀。

3 試驗結果的判定分析

試驗完成后要對結果進行判定并分析原因。若試驗不成立，要查找是否存在試劑盒變質、操作順序有誤、孵育時間、溫度未按要求進行等。即使試驗成立，還應對比陰陽性OD值，若陰性或陽性對照數值的重復性較差，應考慮是否存在加樣量不準確、洗板操作不當等問題。

4 討 論

ELISA試驗操作雖然簡單方便，但不可掉以輕心，稍有不當就會直接影響試驗結果。因此，操作前要做好相關準備、熟悉操作步驟，操作時專心認真、做好標記，最后對試驗結果進行判定分析。日常定期校準移液器，做好酶標儀等儀器設備的維護與保養。