養(yǎng)殖對(duì)蝦的主要病毒性疾病及其免疫防控措施（11）

○張喜貴孟長(zhǎng)明陳昌福

（1河南省新鄉(xiāng)市康大消毒劑有限公司，河南新鄉(xiāng) 453700；2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，武漢 430070）

②生物學(xué)功能Crustins具有抗菌活性和蛋白酶抑制劑活性。在WAP結(jié)構(gòu)域中，N端帶正電荷的氨基酸和疏水性氨基酸的正確定位可使蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出兩性分子特征，而兩性分子蛋白質(zhì)可以插入至微生物細(xì)胞膜中破壞膜結(jié)構(gòu)，從而起到抗菌作用。C端結(jié)構(gòu)域顯示蛋白酶抑制劑活性。與抗菌活性一樣，蛋白酶抑制劑活性在甲殼動(dòng)物免疫應(yīng)答中起到一定作用，通過參與蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，防止蛋白酶的過量激活，從而避免宿主組織的自身?yè)p傷和抵抗病原微生物的感染。

（3）抗脂多糖因子（antilipopolysaccharid factor，ALF）

①種類與結(jié)構(gòu)ALF最初發(fā)現(xiàn)于馬蹄蟹體內(nèi)，是一種具有抗菌作用和結(jié)合脂多糖（LPS）的多肽分子。此后，在白濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦和中國(guó)明對(duì)蝦中也發(fā)現(xiàn)ALF，并且蝦類ALF與馬蹄蟹ALF具有較高的同源性。ALF的相對(duì)分子量約為11.5KDa，由102個(gè)氨基酸殘基組成，N端有20個(gè)高度疏水性氨基酸，在Cys32-Cys53間形成二硫鍵，二硫內(nèi)有保守的正電荷氨基酸。

②生物學(xué)功能ALF能替換LPS分子中的Ca2＋，然后利用它的正電荷特性，結(jié)合到LPS的磷酸基團(tuán)和羧基基團(tuán)上，ALF與LPS結(jié)合后可以阻止啟動(dòng)炎性細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減少組織損傷。此外，LPS是革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素，ALF與LPS的毒性成分類脂A結(jié)合后，可破壞內(nèi)毒素的毒性作用。

（4）來(lái)自血藍(lán)蛋白的抗菌肽

①陰離子抗菌肽Dexstoumieux-Garzon等從細(xì)角濱對(duì)蝦（Penaeus stylirostris）和凡納濱對(duì)蝦（Penaeus vannamei）的血淋巴中分離到3種具有抗真菌活性的陰離子抗菌肽。兩種來(lái)源于細(xì)角濱對(duì)蝦的酸性血漿，相對(duì)分子量分別為7.9KDa和8.3KDa，分別命名為 PsHctl和 PsHct2，PsHct1是PsHct2除去了部分殘基所得到的短肽；另一種來(lái)源于凡納濱對(duì)蝦，相對(duì)分子量為2.7KDa，命名為PvHct。3種陰離子抗菌肽與其他類型的抗菌肽沒有序列上的相似性，但與對(duì)蝦血藍(lán)蛋白的C端氨基酸具有95%～100%的同源性，表明它們是血藍(lán)蛋白的裂解片段。陰離子抗菌肽與陽(yáng)離子抗菌肽最大的區(qū)別是它們?cè)谏韕H條件下帶負(fù)電荷，pI為5.65～6.54，分子結(jié)構(gòu)中不包含銅離子結(jié)合位點(diǎn)。通過免疫檢測(cè)發(fā)現(xiàn)受真菌感染的甲殼動(dòng)物血淋巴中的陰離子抗菌肽濃度高于未被感染動(dòng)物血淋巴中的陰離子抗菌肽濃度，說明陰離子抗菌肽與抗真菌免疫反應(yīng)有關(guān)。同時(shí)，通過體外抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)陰離子抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均未有抗菌活性，但對(duì)真菌顯示出廣譜的抗菌活性。

②Astacidin1Lee等應(yīng)用陽(yáng)離子交換層析和反相HPLC從淡水小龍蝦（Pacifastacus leniusculus）的血淋巴中分離純化了一種具有16個(gè)氨基酸殘基組成的相對(duì)分子量為1.95KDa的抗菌肽，并命名為astacidin1。與小龍蝦血藍(lán)蛋白序列比較發(fā)現(xiàn)：它也是一種來(lái)源于血藍(lán)蛋白C端的抗菌肽，但與同樣來(lái)源于血藍(lán)蛋白C端的3種陰離子抗真菌肽無(wú)同源性。astacidin1的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列為FKVQNQHGQVVKIFHH-COOH，不含糖殘基及半胱氨酸殘基。astacidin1的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)B-折疊結(jié)構(gòu)。Astacidin1對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌均具有抗菌活性，但切去其氨基端后，抗菌活性明顯降低，說明astacidin1的氨基端部分是具有抗菌活性的主要區(qū)域。此外，脂多糖或葡聚糖可以刺激螯蝦血藍(lán)蛋白產(chǎn)生astacidin1。

③來(lái)自血藍(lán)蛋白抗菌肽的產(chǎn)生機(jī)制已有研究表明，許多抗菌肽都是由較大的前體蛋白加工后形成的。如蟾蜍素I是從亞洲蟾蜍胃腺細(xì)胞中的組蛋白H2A經(jīng)胃蛋白酶水解而形成的。從牛蜱腸中分離得到的一種3.2KDa抗菌肽是牛血紅蛋白的分解片段。此外，用人胃蛋白酶裂解牛乳鐵蛋白（Lactoferrin）后產(chǎn)生了具有更高抗菌活性的Lactoferricins片段。這說明金屬結(jié)合蛋白能通過蛋白酶水解作用產(chǎn)生抗菌肽而參加免疫防御反應(yīng)，也為來(lái)自血藍(lán)蛋白的甲殼動(dòng)物抗菌肽的發(fā)現(xiàn)提供了一個(gè)佐證，因?yàn)樗鼈兪怯山Y(jié)合銅的血藍(lán)蛋白產(chǎn)生的。

對(duì)蝦遭受病原微生物感染后，其血淋巴中可檢測(cè)到高濃度的PvHct，說明血藍(lán)蛋白的裂解不是由于抽提過程造成的，而是由生物學(xué)信號(hào)所引起的。雖然血藍(lán)蛋白的加工機(jī)制還不清楚，但推測(cè)它很可能是被來(lái)源于血細(xì)胞的酶所驅(qū)動(dòng)的，因?yàn)榧讱?dòng)物在遭受病原微生物感染后，血細(xì)胞發(fā)生胞吐作用，胞吐作用有助于血藍(lán)蛋白裂解酶的釋放，從而使PvHct的濃度增加。astacidin1也是經(jīng)過半胱氨酸樣蛋白酶對(duì)血藍(lán)蛋白加工而形成的。因此，加深對(duì)這些酶的研究有助于揭示甲殼動(dòng)物的免疫應(yīng)答機(jī)制以及血藍(lán)蛋白在防御中所起的作用。

（未完待續(xù)）