從HBV特異性免疫細胞角度談慢性乙型肝炎功能性治愈

劉小菊， 張 政

1國家感染性疾病臨床醫學研究中心(深圳市第三人民醫院)， 廣東 深圳 518112；2南方醫科大學南方醫院 感染科， 廣州 510515

目前，全球約有2.57億慢性乙型肝炎(CHB)患者，每年約有88.7萬人死于HBV感染相關疾病[1]。極少數的CHB患者可以通過抗病毒治療實現功能性治愈，即完成有限療程治療后，血清HBsAg和HBV DNA持續檢測不到、HBeAg轉陰、伴或不伴HBsAg血清學轉換，肝臟炎癥緩解和組織病理學改善，終末期肝病發生率顯著降低[2]。多數CHB患者需要進行長期甚至終身治療，這無疑給患者和衛生系統帶來巨大挑戰。CHB患者實現功能性治愈代表患者獲得了持久的病毒學抑制和免疫學控制。長期應用一線抗病毒藥物如PEG-IFNα、核苷(酸)類似物(如替諾福韋或恩替卡韋)等可以實現病毒學抑制，但難以實現功能性治愈[3]。目前報道的抗病毒策略，包括病毒進入抑制劑、病毒衣殼釋放抑制劑、免疫調節劑或治療性疫苗，都未能實現更多功能性治愈；其主要原因是肝細胞內仍然殘留HBV cccDNA，且目前缺乏針對HBV cccDNA的特異性靶向藥物，完全消除HBV難以實現[4]。HBV建立慢性感染后，長期持續刺激宿主免疫細胞，肝臟微環境中特異淋巴細胞(CD8 T淋巴細胞和B淋巴細胞)功能被抑制甚至耗竭[5-7]。HBV清除取決于有效的適應性免疫應答，即HBV特異性T淋巴細胞和B淋巴細胞，發揮靶向抑制感染HBV的肝細胞和(或)病毒的效應。本文從特異性免疫細胞角度出發，對HBV特異性T淋巴細胞和B淋巴細胞耗竭及功能重建策略進行總結，為恢復或增強抗HBV適應性免疫提供線索，以實現對HBV的持續免疫學控制。

1 HBV特異性T淋巴細胞耗竭及功能重建

急性自限性HBV感染多表現為強烈的、多表位、多功能性的特異性T淋巴細胞反應；然而慢性感染中，HBV特異性T淋巴細胞反應較弱且功能不足[8]。研究[9-10]發現，肝臟的環境特征，包括肝細胞和肝臟歸巢細胞的耐受性以及慢性HBV感染者肝內富集的IL-10、TGFβ和精氨酸酶等，均對T淋巴細胞功能具有不良影響。CHB患者HBV特異性T淋巴細胞并非完全功能耗竭。在低病毒載量患者中，HBV特異性T淋巴細胞可表現出記憶樣表型，推測可能與接受較弱的HBV抗原持續刺激有關。PD-1等共抑制分子在調節T淋巴細胞效應作用以及T淋巴細胞衰竭中起著核心作用。HBV特異性T淋巴細胞上PD-1的表達，不僅取決于感染的階段，還取決于靶向的HBV表位。不同表位的HBV特異性CD8 T淋巴細胞在細胞分化、調節分子的表達和抗病毒功能上也有所不同。與核心抗原(HBV-core)特異性CD8 T淋巴細胞相比，聚合酶(HBV-pol)特異性CD8 T淋巴細胞則表現出更嚴重的耗竭狀態和更低的增殖能力。因此，不同感染階段不同表位特異性T淋巴細胞具有不同的表型和功能特征[11-12]。在設計和監測HBV特異性T淋巴細胞反應時，必須考慮不同表位引起的潛在偏倚。而且不同表位HBV特異性T淋巴細胞具有不同的治療潛力，并且會對PD-1阻斷劑的免疫治療產生不同的應答。

記憶CD8 T淋巴細胞庫特異識別病毒后能夠大量擴增，并顯著抑制HBV[8]。逆轉耗竭T淋巴細胞功能，可恢復對CHB患者的保護性免疫。額外添加細胞因子可挽救耗竭T淋巴細胞功能。例如，轉錄因子T-bet調節效應CD8 T淋巴細胞中IFNγ和細胞毒性分子的產生，其表達可控制病毒慢性感染。病毒抗原和IL-2刺激誘導T-bet表達可以部分恢復功能受損CD8 T淋巴細胞的功能。IL-12也可增強對病毒的控制，聯合應用IL-12與阻斷PD-1途徑可進一步提高CD8 T淋巴細胞功能[13]。IL-21也具有促進HBV特異性CD8 T淋巴細胞的增殖能力[14]。

研究[15]還發現，HBeAg陰性患者在停止核苷(酸)類似物治療后，HBV復發可能會改變特異性T淋巴細胞表型，并增強其體外對抗原的反應性；阻斷PD-L1可以進一步增強這些HBV特異性T淋巴細胞反應。例如，一項停藥研究[16]顯示，長期抗病毒治療的患者外周血HBV聚合酶/核心抗原特異性T淋巴細胞頻率逐漸增加，并與停藥后肝炎不復發相關；這也提示HBV特異性T淋巴細胞增高患者可以停止抗病毒治療，為臨床提供了一種潛在的免疫學標志。然而，與急性HBV感染者相比，長期治療患者HBV特異性T淋巴細胞的抗病毒能力仍不健全，還需要其他措施來挽救其功能損傷。研究[17]發現，識別HBV表位的PD-1hiT淋巴細胞顯著上調葡萄糖轉運蛋白Glut1，Glut1hiHBV特異性T淋巴細胞依賴于葡萄糖供應。因此，細胞的線粒體功能障礙大大限制了耗竭的HBV特異性T淋巴細胞的代謝可塑性；用線粒體靶向的抗氧化劑有望改善耗竭的HBV特異性CD8 T淋巴細胞抗病毒功能[5]。

2 HBV特異性B淋巴細胞耗竭及功能重建

表面抗體的產生標志著CHB功能性治愈，此時CHB患者體內B淋巴細胞能夠分化為漿細胞，產生針對一系列HBV抗原的多克隆抗體。很多研究[18]已經提示，B淋巴細胞在控制HBV感染中起著重要作用，但抗原特異性B淋巴細胞的檢測一直是個技術難題，阻礙了HBV特異性B淋巴細胞功能的研究。

近期研究[7]顯示，利用雙熒光染料偶聯病毒特異抗原的方法可檢測到外周及組織中特異性B淋巴細胞。已經發現HBV表面抗原特異性B淋巴細胞在慢性HBV感染中持續存在，但與HBsAg滴度無顯著相關性。這種細胞也存在于乙型肝炎疫苗接種者和HBV感染恢復者體內。利用高通量流式細胞分選技術可以從CHB患者中分離出HBsAg特異B淋巴細胞。體外實驗提示，CHB患者HBsAg特異性B淋巴細胞增殖能力降低，且在刺激后不能產生抗-HBs。但HBsAg轉陰患者，其HBsAg特異性B淋巴細胞卻能在刺激后產生抗-HBs，提示其功能損傷獲得恢復。進一步分析顯示，CHB患者HBsAg特異B淋巴細胞和總B淋巴細胞中經典記憶性細胞亞群減少，而非經典記憶B淋巴細胞增加。這種非經典記憶B淋巴細胞主要特征是CD21和CD27低表達，但抑制性標志物PD-1和轉錄因子T-bet高表達；并且這類細胞在肝臟感染部位積聚，其抗病毒/炎癥細胞因子產生等能力以及分化成抗體生成細胞的能力均顯著降低。這種表型和功能障礙不僅局限于HBsAg特異性B淋巴細胞，還影響HBV感染者的整體B淋巴細胞群。阻斷PD-1或添加IL-2、IL-21和CD40配體可在體外部分恢復HBsAg特異性B淋巴細胞功能[6-7,19]。因此，B淋巴細胞功能障礙是HBV感染者不能產生抗-HBs的主要原因之一。然而，還有許多問題懸而未決。例如，導致HBsAg特異性B淋巴細胞功能障礙的細胞和分子機制還不清楚，機體B淋巴細胞亞群受損機制和臨床意義也不明確。未來研究應力圖尋找恢復HBsAg特異性B淋巴細胞功能的最佳策略。

利用雙熒光染料偶聯的HBcAg同樣可以檢測到HBcAg特異性B淋巴細胞。研究[20]發現，CHB患者體內HBcAg特異性B淋巴細胞頻率高于HBsAg特異性B淋巴細胞。并且，與HBsAg特異性B淋巴細胞不同，HBcAg特異性B淋巴細胞在體外可以有效分化為抗體分泌細胞。在慢性HBV感染者中，血清抗HBcAg水平與HBcAg特異性B淋巴細胞的數量和功能顯著相關[20]。值得注意的是，HBcAg特異性B淋巴細胞除了產生抗-HBc外，可能還具有其他免疫調節作用。例如，抗-HBc可能會推動急性暴發性肝炎的發生發展；在肝臟中抗-HBc與HBcAg形成大顆粒抗原抗體復合物，可以激活經典的補體途徑從而加重肝壞死[21]。因此，將來研究應進一步加強抗-HBc在CHB中的發病機理研究，以及HBcAg特異性B淋巴細胞抗體產生能力與功能性治愈的關系研究。

3 總結與展望

總之，從免疫學角度來看，實現CHB功能性治愈治療HBV慢性感染的首要目標應該是恢復患者HBV特異性T淋巴細胞和B淋巴細胞的數量和功能。將來免疫治療策略需要聯合應用抗病毒藥物，才能有效降低HBV抗原載量并恢復耗竭的抗HBV特異性免疫細胞功能。