非洲豬瘟診斷技術研究進展

朱小甫，吳旭錦

(咸陽職業技術學院 畜牧獸醫研究所，咸陽市動物疫病分子生物學診斷技術研究重點實驗室，陜西 咸陽 712000)

非洲豬瘟(ASF)的病原是非洲豬瘟病毒(ASFV)，該病傳播速度快，發病率、病死率高，對社會經濟造成巨大影響，在我國動物防疫法中被列為一類動物疫病[1]。ASFV在分類上屬非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬，典型二十面體結構，大小約200nm，遺傳物質為雙股線性DNA，堿基數170～190 kb[2]。由于ASFV結構復雜，學界對其大多數蛋白結構與功能尚不清楚，亦無有效疫苗投入臨床應用，在預防ASF方面面臨很多困難[3]。2018年8月，我國首例ASF出現在遼寧沈陽，疫情迅速蔓延全國，我國生豬產業損失慘重[4]。為盡快控制撲滅疫情，除了加快研發有效疫苗外，更為現實和重要的是依靠診斷技術做到早診斷、早撲殺感染動物，消除傳染源和疫點。總的來看，ASF診斷技術分為臨床與病理診斷、血清學方法和病原學方法三大類，現綜述如下，以期為診斷防控ASF提供參考。

1 臨床與病理診斷

ASF臨床表現與病毒毒力、感染劑量與途徑有關。最急性型表現為豬只無明顯臨床癥狀的突然死亡。急性型表現為高熱(40～41℃)，食欲不振，皮膚出血，先便秘后腹瀉帶血，死亡率極高。慢性型臨床癥狀溫和，主要表現為食欲減退，輕微發熱，精神差，有呼吸道癥狀，懷孕母豬流產[5]。病理變化上以急性型表現最為特征，脾臟顯著腫大，質地變脆，色澤發黑，切面隆起有多量黑紅色液體流出。淋巴結腫大，表面有出血點或出血斑，切面呈花斑狀。有的病例中可見心包積水，心外膜內膜有出血點。胸腔積水，肺臟水腫有淤血。腎臟皮質與髓質有出血點。肝臟、膽囊充血，腸道漿膜點狀或斑片狀出血，黏膜彌漫性出血。膀胱黏膜有點狀出血。病毒侵害中樞神經引起腦膜點狀出血[6]。需要指出的是，以上癥狀與病變并不是ASF特有，豬瘟、高致病性豬藍耳病以及敗血性鏈球菌病等均有類似表現，因此依據癥狀與病變只能診斷為疑似病例，確診需要實驗室方法[7]。

2 病原學診斷

ASFV病原診斷技術有三類，即病毒分離、病毒抗原檢測和基因組DNA檢測。病原檢測適用范圍廣，在潛伏期、發病初期均可應用。

2.1 病毒分離

OIE推薦ASF診斷的黃金標準是病毒分離，常用紅細胞吸附試驗(HAD)進行ASFV分離確診[8]。其原理是，如果豬的單核細胞或巨噬細胞被ASFV感染，這些細胞就具有吸附豬紅細胞的能力。用疑似感染豬血清或病料處理液接種培養的原代白細胞進行HAD，或用感染豬外周血白細胞作“自動玫瑰花環”HAD。培養完成后鏡檢，發現在感染細胞上有紅細胞吸附即可判定為陽性。ASFV抗體可阻斷該病毒吸附紅細胞，據此設計的紅細胞吸附抑制試驗(HADI)用來測定抗體水平或測試不同分離株是否在抗原性上存在差異[9]。HAD技術的缺點是耗時長，操作復雜，需要借助其他檢測方法進行判定，不適合快速診斷。

2.2 熒光抗體檢測病毒抗原

熒光抗體法(FAT)檢測ASFV，用待檢組織作冰凍切片或壓印片，或在載玻片上涂開已接種的白細胞培養物的細胞沉淀，干燥后浸入丙酮中固定，用熒光抗體染色后沖洗，在熒光顯微鏡下觀察，如果胞漿中發現特異性熒光，即判為陽性。FAT可用來檢測疑似病例組織中有無ASFV，也可用于確定無HAD現象的白細胞培養物中是否存在ASFV，即能鑒定無HAD能力的毒株。FAT還可鑒別CPE是由ASFV和其他病原、或有細胞毒性的接種物引起。但在檢測慢性感染病例時FAT靈敏度較低，可能是抗原抗體復合物干擾的結果[10]。

2.3 膠體金檢測病毒抗原

吳海濤等[11]用大腸桿菌表達ASFV P72蛋白，免疫兔制備高免血清，用雜交瘤細胞制備ASFV單抗，將上述ASFV多抗和單抗純化，在硝酸纖維素膜上包被SPA作為質控線，包被ASFV多克隆抗體作為檢測線，制成檢測ASFV的試紙條。為了驗證試紙條的實用性與可靠性，測試抗原為兩種基因工程表達的ASFV P72蛋白，發現制備的試紙條在5～10 min內可準確識別兩種蛋白抗原，對兩種抗原的最低識別量分別為15 ng和21 ng。膠體金檢測操作簡單快捷，穩定性好，檢測成本低，但只可定性不可定量，適用于ASFV初步篩查。

2.4 基因組DNA檢測

2.4.1 普通PCR技術 PCR技術的出現極大地推動了分子生物學的發展，應用PCR技術擴增病原核酸特異性片段診斷相應的疫病成為實驗室常用技術手段，OIE官方推薦PCR作為ASFV檢測方法之一。PCR方法的優點是快速、敏感，特異性好，不需要病毒分離即可快速診斷。吳憶春[12]以人工合成的ASFV VP73基因為模板，設計特異性引物，建立PCR方法并組裝成試劑盒，該試劑盒與常見的6種豬病毒、健康豬和蟬的基因組無交叉反應，檢測重組質粒敏感性極限為0.1 fg，與OIE推薦的引物敏感性相當。楊吉飛等[13]根據ASFV VP72基因設計了檢測ASFV的PCR方法，與豬的13種常見病毒、細菌、衣原體核酸無交叉反應，敏感性與OIE推薦方法類似，所建立的PCR方法能準確擴增17個ASFV分離株的基因組，驗證了方法的有效性。Luo Y等[14]根據p72基因設計引物，用建立的PCR方法檢測了不同地區I、V、VIII、IX 4個基因型14個代表毒株，該方法比OIE的兩種PCR更為靈敏，檢測ASFV基因型更為全面。

2.4.2 多重PCR技術 多重PCR技術可以一次性檢測多種病原核酸，檢測效率高，節約試劑耗材成本，被廣泛應用于動物疫病檢測。冷依伊等[15]針對水皰性口炎病毒、非洲豬瘟病毒、豬口蹄疫病毒、豬偽狂犬病病毒和豬瘟病毒5種病原設計引物，建立了五重RT-PCR鑒別診斷方法，該方法對CSFV、PRV、ASFV、FMDV和VSV的核酸檢測極限分別為6.87×104拷貝·μL-1、8.82×103拷貝·μL-1、5.71拷貝·μL-1、4.32×102拷貝·μL-1和4.93×104拷貝·μL-1。張倩等[16]采用OIE推薦的ASFV檢測引物，再設計一對檢測豬瘟病毒的引物，建成了檢測這兩種病原的雙重PCR方法，該方法在一個反應體系中同時擴增兩個不同病毒目的基因，檢測極限為100 pg的DNA，具有省時、快速的特點。

2.4.3 納米PCR技術 納米PCR是在普通PCR反應體系中加入固體納米金屬顆粒，形成熱導性更強的納米流體，PCR反應溫度調節更快，可消除非特異性擴增，提高反應的特異性和擴增產物產量[17]。崔尚金等[18]采用納米PCR方法檢測ASFV與其他7種常見豬病原，結果顯示僅ASFV能成功擴增，敏感性試驗表明，該方法檢測極限為43拷貝·μL-1，而普通PCR檢測極限為4.3×104拷貝·μL-1，納米PCR法靈敏度增加了1 000倍。

2.4.4 實時熒光定量PCR技術 熒光定量PCR技術(qPCR)采用熒光素標記特異性核酸探針，或用熒光染料插入PCR雙鏈產物，通過熒光信號強弱變化實時監控反應過程，用軟件計算分析樣品模板濃度。qPCR不需要電泳成像，檢測過程簡化，且真正實現了絕對定量。李洪利等[19]根據p72基因序列設計熒光定量引物與探針，建立了qPCR方法，該方法檢測極限為10拷貝·μL-1。郭少平等[20]針對K205R基因設計并建立了qPCR檢測方法，提取豬肝組織DNA，摻入ASFV K205R基因重組質粒作為模板，確定檢測效率，以OIE推薦的qPCR方法作為對照，試驗證實，建立的qPCR效率比OIE推薦方法要高。王建華等[21]針對ASFV CP530R基因和HP-PRRSV NSP2基因設計檢測引物與探針，建成一種二重熒光RT-PCR檢測方法，該方法對ASFV和HP-PRRSV可特異性擴增，最低檢測極限分別為61拷貝·μL-1和41拷貝·μL-1，重復性試驗表明該方法具有良好的重現性。

2.4.5 環介導等溫PCR技術 環介導等溫PCR技術(LAMP)是一種基于鏈置換DNA聚合酶的恒溫核酸擴增方法，該方法針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，在63℃左右恒溫30～60min完成核酸擴增，不需要常規PCR的核酸模板變性、退火、延伸等循環過程，無需電泳成像，只要有簡單的恒溫設備即可完成，具有簡單、低成本、快速、特異的特點。王彩霞等[22]合成了ASFV P72全長基因，設計了環介導恒溫擴增的內、外引物，建成了LAMP診斷方法，該方法檢測下限為10拷貝/μL，特異性良好。楊吉飛等[23]根據ASFV P72基因設計LAMP檢測引物，對豬基因組、蜂基因組與已知的ASFV基因組進行檢測，結果僅ASFV基因組能擴增，豬與蜂的基因模板為陰性。王建昌等[24]建立了一種基于ASFV P72基因的重組酶聚合酶等溫擴增方法，在38℃恒溫0.5h即可有效擴增目的基因，以P72基因質粒為模板，檢測極限達到200個拷貝，與OIE qPCR靈敏度一致，比OIE PCR方法高10倍，方法簡單快速，成本較低，是非洲豬瘟一線防控可靠的技術手段。

2.4.6 微滴數字PCR技術 微滴數字PCR(ddPCR)是一種全新的絕對定量技術，通過稀釋實現單個模板分子擴增，利用泊松分布原理和終點法PCR，通過軟件分析計算出模板濃度。ddPCR無需繪制標準曲線，低濃度模板也可精準定量，該技術引起國內外的高度關注和應用。鄔旭龍等[25]設計并建立了ASFV qPCR和ddPCR檢測方法，評估了這兩種方法的特異性、靈敏性、重復性和線性關系，檢測了163份國內外的血清和組織樣品，用ASFV ELISA試劑盒復檢了血清樣品，計算不同方法檢測符合率，結果建立的qPCR和ddPCR檢測方法有良好的線性關系，ddPCR靈敏度可達0.36個拷貝，靈敏度比qPCR高10倍。

2.4.7 交叉引物擴增-試紙條法 Gao Yao等[26]選擇ASFV基因的高保守區域，設計檢測引物與探針，探針用異硫氰酸熒光素和生物素標記，同樣用異硫氰酸熒光素和生物素標記CPA擴增產物的末端，在試紙條檢測線區域會形成膠體金-抗異硫氰酸熒光素抗體-擴增產物-抗生物素抗體偶聯復合物，檢測線處固定膠體金，陽性結果檢測線會顯示顏色變化，建成交叉引物擴增-診斷試紙聯合使用的檢測方法，該方法檢測下限為200拷貝·μL-1，試紙條重復性好，全血樣品檢測顯示與qPCR的符合率為97.8%。這種方法先通過交叉引物進行等溫PCR擴增，再用試紙條檢測產物，不需要儀器設備，實現現場快速診斷，適合現地檢測需求，應用前景廣闊。

3 血清學診斷

3.1 ELISA檢測技術

龔振華等[27]參考非洲豬瘟病毒P54基因序列，通過人工合成P54基因，克隆至表達載體構建重組質粒，結果顯示，該質粒可高效表達分子量約20.7 ku的P54蛋白，該蛋白具有可溶性，易于純化，能特異性識別ASFV陽性血清，ELISA試驗顯示，P54蛋白針對ASFV陽性血清和陰性血清的P/N值為1.67，結果證實用該蛋白建立的ELISA方法可用于非洲豬瘟抗體診斷。靳雯雯等[28]采用基因工程技術制備ASFV VP73蛋白，以此蛋白包被ELISA板，建立了間接ELISA測定ASFV抗體的方法，靈敏性測試表明，該方法可檢測到1 ∶2 560稀釋的標準陽性血清，與同類進口ELISA試劑盒相當，特異性和重復性良好。董志珍等[29]以基因工程技術制備的ASFV P54蛋白免疫小鼠，制備ASFV單克隆抗體，制作成競爭ELISA檢測ASFV抗體的試劑盒，該方法特異性高，比間接免疫熒光法靈敏度高。

3.2 膠體金試紙檢測技術

張鑫宇等[30]原核表達了p54蛋白，用膠體金標記蛋白，以玻璃纖維墊為載體，噴涂標記蛋白，質控線為抗p54多克隆抗體，檢測線為SPA，制成了檢測試紙條。該試紙條檢測抗體的靈敏度為200 ng·mL-1，檢測豬常見病毒抗體陽性血清均為陰性，提示試紙特異性高。應用試紙檢測141份豬血清樣品，結果發現對于ASFV早期感染的診斷上，該試紙比OIE推薦的間接ELISA要好。以免疫印跡法為參照，在檢測疫區臨床陽性樣品上，該試紙條的符合率比OIE推薦的ELISA要高。試紙表現出了良好的應用效果，具有良好的開發前景。

3.3 量子點免疫層析試紙技術

林彥星等[31]利用軟件分析ASFV VP73蛋白的氨基酸序列，選擇優勢抗原表位區域后合成多肽，將其偶聯上牛血清白蛋白，選取抗原性好的多肽作為檢測線包被抗原采用量子點標記葡萄球菌蛋白A，抗葡萄球菌蛋白A的多克隆抗體作為質控線的包被蛋白，制成了檢測ASFV抗體的量子點免疫層析試紙。試驗結果顯示，該試紙條特異性良好，與普通豬病陽性血清無交叉，同時用進口ELISA試劑盒檢測進行對比，結果完全符合。制成的試紙操作簡便，在ASFV抗體的現場檢測方面具有優勢。

4 小結與展望

自ASF傳入我國以來，短時間對我國養豬業造成了巨大打擊，給社會生活造成了一定的影響。為了控制ASFV的蔓延傳播，急需短時、特異、準確、方便的診斷手段。病毒分離是ASFV診斷的金標準，但分離鑒定需要較長時間，分離物需要輔助手段進行鑒定，因此只適合進行病原研究，不能用于快速診斷。PCR技術樣本來源多樣化，操作簡單快速，靈敏特異，適合快速診斷。熒光定量PCR是目前主要推廣使用的快速診斷方法，該方法能實時監測反應過程，對模板可絕對定量，但該方法易產生假陽性結果，檢測中要嚴格設立對照，且對檢測環境和操作技術要求很高。環介導等溫PCR技術快速準確，成本低，結果直觀，不需要特殊設備，適用于現場便攜式診斷，該方法缺點是低濃度模板單一溫度擴增會導致產生非特定產物，易形成氣溶膠污染造成假陽性。ELISA方法是國際貿易指定試驗方法，但該方法技術要求高，鑒定時程長，對儀器設備依賴性較大。目前急需現場快速診斷技術支持豬場現地篩查，為迅速控制疫情爭取時間。環介導等溫PCR技術和膠體金技術主要優點就是耗時更短、不需要特殊設備即可進行，因而是重要的技術開發方向。需要指出的是，ASF診斷是防控的第一步，撲滅疫情需要在診斷的基礎上結合撲殺、消毒、限制病原傳播、生物安全等綜合措施，才能有效控制并達到消滅ASF的目的。