復合型腎虛質大鼠神經行為障礙與NMDA受體表達研究

孫瑜嬬等

摘要：目的 探討腎虛質與腦功能衰退的相關性及腎藏志理論的物質基礎與神經生物學機制。方法 采用“貓嚇鼠”造模法造成先天不足加后天失養復合型腎虛模型，隨機分為模型組、左歸丸組和右歸丸組；空白組產自正常孕鼠。對仔鼠恐嚇同時開始灌胃，左歸丸組、右歸丸組分別給予左歸丸、右歸丸混懸液，空白組和模型組給予等量生理鹽水，1次/d，連續2個月。懸吊試驗和Y迷宮實驗觀測大鼠運動和空間學習記憶能力，免疫組化法檢測N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體亞基NR2A、NR2B蛋白表達。結果 懸吊試驗：模型組持續時間低于空白組（P<0.05），左歸丸組和右歸丸組高于模型組（P<0.05）；Y迷宮實驗：模型組跑至安全區正確次數低于空白組（P<0.05），左歸丸組和右歸丸組高于模型組（P<0.05）；模型組NR2A、NR2B光密度值較空白組降低（P<0.05），左歸丸組和右歸丸組光密度值較模型組升高（P<0.05）。結論 腎虛質大鼠神經行為學異常且海馬NMDA受體亞基表達降低；左歸丸、右歸丸可上調NMDA受體表達且改善大鼠腦功能，揭示了腎虛質與腦功能衰退的相關性及腎藏志理論的物質基礎與神經生物學機制。

關鍵詞：腎虛質；懸吊試驗；Y迷宮實驗；NR2A蛋白；NR2B蛋白；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.015

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）09-0052-04

Study on Neurobehavioral Disorders and NMDA Receptor Expression in Rats with Kidney-deficiency Constitution SUN Yu-ru， SUN Yao-guang， ZHANG Qi， WANG Xiao-di， WANG Xing， SUN Li-jun （Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， China）

Abstract：Objective To discuss the correlation between kidney-deficiency constitution and brain function decline， and material basis of kidney-storing-spirit theory and neurobiology mechanism. Methods By employing the method of “cats scare rats”， composite offspring rat models with deficiency and acquired dystrophy were built， then they were divided into model group， Zuogui Pill group and Yougui Pill group. Blank group was composed from normal pregnant rats. When the intimidation of offspring began， Zuogui Pill and Yougui Pill groups received gavage with corresponding doses of medicine， 1 times per day for 2 consecutive months. Model and blank groups received the same amount of normal saline. Exercise capacity was detected by suspension test. Learning and memory capacity was detected by Y maze test. Expressions of NMDA receptor subunits NR2A and NR2B were detected by immunohistochemical method. Results In suspension test， the duration of model group was shorter than blank group （P<0.05）， while duration of Zuogui Pill and Yougui Pill groups was longer than the model group （P<0.05）. In Y maze test， the correct number of model group was less than blank group， and increased significantly after treatment （P<0.05）. The optical density of NR2A and NR2B was lower in model group than blank group （P<0.05） and higher in Zuogui Pill and Yougui Pill groups than model group （P<0.05）. Conclusion The neurobehavioral is abnormal and NMDA receptor expression depresses in rats with kidney- deficiency constitution. Zuogui Pill and Yougui Pill can rise NMDA receptor expression and improve brain function of rats， which reveal the correlation between kidney-deficiency constitution and brain function decline， and material basis of kidney-storing-spirit theory and neurobiology mechanism.

Key words：kidney-deficiency constitution；suspension test；Y maze test；NR2A；NR2B；rats

基金項目：陜西省科技廳研究項目（2013JM4033）；陜西省重點實驗室研究項目（13JS031）

《靈樞·本神》曰：“恐懼而不解則傷精，精傷者則骨酸痿厥，精時自下。”王冰注釋：“恐而不已則內感于腎，故傷也。”中醫理論認為，腎為先天之本，藏有先天之精和后天之精，腎精的盛衰決定著子代稟賦的強弱。腎藏精生髓，腦為髓海，主神志思維，司機體運動。髓由腎精及氣血所化，充養腦實質，腎虛則經不上承而腦髓空虛、腦竅失養致腦失其用[1]。本實驗以腎虛質大鼠運動、學習等神經行為學改變和海馬N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體亞基NR2A、NR2B蛋白表達為切入點，探討腎虛質和腦功能衰退的相關性，以及腎藏志理論的物質基礎和神經生物學機制。

1 實驗材料

1.1 動物

8周齡清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，體質量200～300 g，西安交通大學醫學院實驗動物中心，許可證號SCXK（陜）2007-001。標準飼料喂食，不限飲水，室溫。雌雄土貓各1只，3月齡，兇狠善叫，鮮活大鼠喂食，不限飲水，室溫。

1.2 主要藥物、試劑與及儀器

左歸丸（批號100306）、右歸丸（批號110309），河南省宛西制藥股份有限公司。DAB顯色試劑盒、SABC試劑盒、枸櫞酸緩沖液、水合氯醛、乙醇、多聚甲醛、30%蔗糖溶液、OCT包埋劑、30%H2O2、NR2A、NR2B一抗、二抗（武漢博士德生物技術公司）。Y迷宮（上海軟隆科技發展有限公司），電子天平、冰凍切片機、顯微鏡等。

2 實驗方法

2.1 分組與造模

參照本課題組前期研究方法[2]，大鼠適應性飼養1周，按雄性∶雌性=1∶2比例合籠交配。成功受孕后將孕母鼠隨機分為對照組和腎虛組，每組10只。腎虛組孕鼠置于特制鼠籠，于8：00-19：00置于貓籠旁進行恐嚇，同時在貓籠內放置雄鼠令其捕食使孕鼠在旁處于恐慌狀態。對照組孕鼠不作刺激處理。非恐嚇時間2組均置于同處并確保其他非處理因素一致，至2組孕鼠產子，將仔鼠飼養4周后進行分組。空白組從對照組孕鼠所產仔鼠中隨機選取10只；腎虛組孕鼠所產仔鼠隨機選取30只，分為模型組、左歸丸組和右歸丸組各10只，繼續對此3組仔鼠實施上述“貓嚇鼠”方案，持續個1月。空白組仔鼠零刺激，非恐嚇時間4組仔鼠均置于同處減小非處理因素。

2.2 給藥

大鼠用藥量約為成人的6.25倍[3]。左歸丸每10丸含原藥材1 g，成人每日服18 g，則大鼠每日服1.875 g/kg，蒸餾水配成1.875 g/mL混懸液備用。右歸丸每8丸含原藥材3 g，成人每日服9 g，則大鼠每日服0.937 5 g/kg，蒸餾水配成0.937 5 g/mL混懸液備用。對仔鼠恐嚇同時開始給藥，藥物組分別予上述混懸液灌胃，空白組和模型組予等量生理鹽水灌胃，給藥體積10 mL/kg，每日1次，每周用藥5 d，停2 d， 連續2個月。

2.3 神經行為學檢測

2.3.1 懸吊試驗 各組仔鼠8周齡時進行懸吊試驗，使仔鼠前爪抓住距桌面50 cm高水平放置的玻璃棒（棒長約40 cm，直徑0.6 cm），記錄仔鼠掉至桌面的時間，計分評判仔鼠運動能力。評分標準：<10 s計1分，10～30 s計2分，>30～120 s計3分，>2～5 min計4分，>5 min計5分。每只仔鼠懸吊3次，每次休息10 min，取3次平均值。

2.3.2 Y迷宮實驗 各組仔鼠10周齡時進行Y迷宮實驗，Y迷宮三條臂盡頭均有一盞15 W燈泡，底部為電網，電壓50～70 V。實驗時一條臂燈亮，底部電網不通電為安全區；另兩側燈不亮，延時5 s后底部通電為非安全區，刺激仔鼠使其跑向安全區。仔鼠到達安全區30 s后隨機更換安全區位置，10 s內順利從非安全區一次性跑到安全區則判為正確。每只仔鼠實驗后75%酒精擦洗Y臂以排除氣味干擾。實驗第1日為適應階段，每只仔鼠在Y迷宮中自由活動5 min；第2～4日為學習訓練階段，每只仔鼠從同一臂即起始臂放入Y迷宮，30次/d，持續訓練3 d；第5日為測試階段，記錄30次測試中仔鼠正確進入安全區的次數。

2.4 NR2A、NR2B蛋白表達檢測

2.4.1 組織提取及切片 各組仔鼠用藥2個月、禁食12 h后稱重，7%水合氯醛0.05 mL/kg腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注，取海馬4%多聚甲醛4 ℃固定4～6 h，PBS沖洗5 min×3次，置30%蔗糖4 ℃過夜，PBS洗5 min×3次、干燥、OCT包埋，冰凍切片，室溫靜置1 h待測。

2.4.2 免疫組化法檢測 切片置于甲醇新鮮配制的0.3%雙氧水，室溫封閉20 min，消除內源性過氧化物酶，PBS洗5 min×3次，置于0.01 mol/L pH 6.0枸櫞酸緩沖液95 ℃，煮沸15 min，冷卻后PBS洗5 min×3次，5%BSA 37 ℃封閉20 min，棄多余液體；滴加稀釋后一抗，4 ℃過夜，取出復溫，PBS洗5 min×3次，滴加二抗， 37 ℃溫浴30 min，PBS洗5 min×3次，，滴加新鮮配制的DAB顯色液避光顯色，鏡下控制顯色程度，雙蒸水洗終止顯色，蘇木素復染，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，37 ℃干燥過夜，光鏡下觀察拍照，應用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析，對陽性細胞測定平均吸光度值。

3 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 神經行為學檢測結果

4.1.1 懸吊試驗 模型組懸吊持續時間明顯低于空白組（P<0.05），左歸丸組和右歸丸組持續時間明顯高于模型組（P<0.05），見表1。

4.1.2 Y迷宮實驗 模型組進入安全正確次數明顯低于空白組（P<0.05），左歸丸組和右歸丸組正確次數明顯高于模型組（P<0.05），見表2。

4.2 補腎中藥對NR2A、NR2B蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組NR2A、NR2B平均吸光度值明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，左歸丸組和右歸丸組平均吸光度值明顯升高（P<0.05）。鏡下觀察顯示，空白組神經細胞較多，細胞結構致密且層次清楚；模型組腦組織存在散在的片狀水腫，神經細胞數目減少、細胞結構松散；左歸丸組和右歸丸組大腦皮質海馬區神經細胞較多，細胞結構致密且層次清楚，無明顯水腫區。結果見表3、圖1、圖2。

5 討論

腎虛質是各類人群中常見的體質類型之一，是一種以腎中精氣虧虛、腎臟功能低下為主要特征的體質狀態[4]。中醫情志學說有“腎藏志，在志為恐”，一方面，“腦為元神之府”，是“腎藏志”理論中“志”產生活動的中樞部位；另一方面，“腦為髓之海”，腎虛則髓不實，腎虛以“髓”為中介反作用于腦，直接影響機體運動與思維。

臨床研究表明，腎虛質多包含腦神經行為方面的障礙[5-7]。懸吊試驗是隨意運動檢測，主要反映肌力、軀體平衡力及上肢運動力。實驗中模型組仔鼠運動力低于空白組，通過補腎藥物治療后結果逆轉。Y迷宮實驗主要應用于動物的辨別性學習、工作記憶及參考記憶的測試，因其受實驗環境、溫度和操作等影響較小而廣泛應用于學習和記憶研究領域[8]。Y迷宮實驗中，模型組較空白組正確次數降低，表明腎虛對運動功能和

空間學習記憶力的抑制作用及補腎藥物的治療作用。

研究表明，NMDA受體與突觸傳遞長時程增強、突觸可塑性、學習記憶、神經系統生長發育的可塑性、缺血缺氧損傷、中樞神經系統內的疼痛傳導、術后認知功能障礙及老年性癡呆等神經退行性疾病等都有密切關系[9]。NR2A與NR2B是NMDA受體的2個重要亞基，在皮層特征性發育轉變中具有重要作用，且主要與學習記憶的獲得關系密切[10-11]。所以，本實驗選取NR2A、NR2B的表達為切入點，從神經生物學角度揭示腎虛質對腦學習記憶能力的抑制性影響。實驗結果顯示，腎虛質組NR2A與NR2B的低表達及補腎藥物干預后的表達回升均反映出與前期研究結果一致，即腎虛質抑制性影響腦功能。

腎虛體質主要表現為腎精虧虛，腎藏精是腎的最基本功能，腎精所產生的生理效應有腎陰、腎陽兩大方面，故實驗中設立了補腎陰的左歸丸組和補腎陽的右歸丸進行觀察。作為補腎中藥的代表方，左歸丸、右歸丸可影響老年大鼠大腦邊緣系統（海馬、杏仁核）對下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺（HPAT）軸的調控作用，可糾正老年大鼠神經內分泌功能的異常變化[12]，并且可以通過提高腦源性神經營養因子及其受體TrkB的基因表達改善老年大鼠的學習記憶能力[13]。實驗結果顯示，給予左歸丸、右歸丸治療后，仔鼠運動能力、空間學習記憶能力及NMDA受體亞基表達均有所提高，說明本研究所建立的腎虛體質動物模型主要表現為腎精虛，精虛不能舍志從而導致大腦功能減退。提示補腎中藥可用來治療有腎虛質特征的腦功能障礙，同時提示NMDA受體是腎藏志理論中重要的物質基礎，揭示了腎藏志理論的神經生物學機制。

參考文獻：

[1] 牛磊.論腎虛與帕金森病的關系[J].中國中醫藥信息雜志，2011， 11（18）：99-100.

[2] 孫理軍，李翠娟，王震，等.腎虛質實驗動物模型的構建方法與評價[J].時珍國醫國藥，2013，24（1）：247-249.

[3] 何誠.實驗動物學[M].北京：中國農業大學出版社，2006：283.

[4] 孫理軍，李翠娟，王震，等.關于腎虛質實驗動物模型相關問題的研究與思考[J].時珍國醫國藥，2012，23（12）：3094-3095.

[5] MacDonald JF， Jackson MF， Beazely MA. Hippocampal long-term synaptic plasticity and signal amplification of NMDA receptors[J]. Crit Rev Neurobiol，2006，18（1/2）：71-84.

[6] Yamin G. NMDA receptor-dependent signaling pathways that underlie amyloid beta-protein disruption of LTP in the hippocampus[J]. J Neurosci Res，2009，87（8）：1729-1736.

[7] Kullmann DM， Lamsa K. Roles of distinct glutamate receptors in induction of anti-Hebbian long-term potentiation[J]. J Physiol， 2008，586（6）：1481-1486.

[8] Stout JC， Weiss JM. An animal model for measuring behavioral responses to anxiogenic and anxiolytic manipulations[J]. Pharmacol Biochem Behav，1994，47（3）：459-465.

[9] 唐啟盛，包祖曉，曲淼，等.腎與神志關系的探討[J].北京中醫，2006， 25（9）：538-540.

[10] White TL， Youngentob SL. The effect of NMDA-NR2B receptor subunit over-expression on olfactory memory task performance in the mouse[J]. Brain Research，2004，1021（1）：1-7.

[11] Mathur P， Graybeal C， Feyder M， et al. Fear memory impairing effects of systemic treatment with the NMDA NR2B subunit antagonist， Ro 25-6981， in mice：Attenuation with ageing[J]. Pharmacol Biochem Behav，2009，91（3）：453-460.

[12] 戴薇薇，金國琴，張學禮，等.左歸丸、右歸丸對老年大鼠海馬、杏仁核氨基酸類神經遞質含量變化的影響[J].中華中醫藥雜志，2005，20（7）：397-400.

[13] 戴薇薇，金國琴，張學禮，等.左歸丸、右歸丸對衰老大鼠海馬學習記憶相關基因BDNF mRNA表達的影響[J].中藥藥理與臨床，2007，23（4）：14-16.

（收稿日期：2015-01-05）

（修回日期：2015-01-28；編輯：華強）