桑樹內生真菌的分離、鑒定及其對DNJ生物合成的影響

駱麗如，曾澤南，謝文杰，胡璐曼，唐忠海

（湖南農業大學食品科學技術學院，湖南長沙410128）

桑樹枝葉的藥用功效在《本草綱目》已有較多記載[1-2]，且我國已將桑樹枝葉作為治療消渴癥（糖尿?。┑闹兴幹唬瑧糜谂R床[3]。上個世紀80年代，日本科學家指出，桑樹枝葉中的1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是治療糖尿病的有效物質[4-5]。DNJ的化學結構[6]與葡萄糖相似，是桑樹枝葉中的一種哌啶生物堿[7-8]。在自然界中，桑樹枝葉中DNJ含量最高[9]。周炎等[10]通過灌胃等量桑枝水提液、二倍量桑枝水提液、鹽酸二甲雙胍片，高血糖小白鼠的血糖值4周后分別下降了7.63%、15.72%、18.41%，綜合相關研究表明，桑葉枝葉中豐富的DNJ是α-葡萄糖苷酶的一種抑制劑[11]，具有降低血糖[12-15]、抑制病毒活性和抑制腫瘤轉移等作用[16-18]。

微波提取法、超聲波輔助提取法和超臨界萃取技術[19-20]等作為新技術已經應用于DNJ的提取，其中胡瑞君等[21]利用微波萃取技術提取桑葉中DNJ，確定最佳提取工藝條件為：微波功率406 W，微波處理時間1.5 min，固液比 1 ∶40（g/mL），提取次數 2 次，DNJ提取率為0.024%?；←惖萚22]通過超聲波輔助提取法確定了提取DNJ的最佳條件為：超聲功率125 W，每克桑葉浸提劑用量40 mL，超聲溫度70℃，超聲時間20 min，DNJ的得率為0.091%。由于DNJ分子在紫外、可見光波段內無吸收峰，因此常規的分光光度法無法檢測其存在和含量[23]，而常采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測法[24-25]、柱前衍生化高效液相色譜法[26-27]、氣相法[28]等方法檢測DNJ。

研究與開發內生真菌已成為解決某些植物藥藥源危機的最佳途徑之一[29]。現已證明，內生真菌能夠參與植物活性成分的合成或對植物的次級代謝產物有轉化作用[30]。同時，桑樹內生真菌具有豐富的生物多樣性[31]且能產生黃酮類物質[32]。本試驗通過分離桑樹中內生真菌及其發酵試驗，培養并鑒定內生真菌，通過FMOCCl柱前衍生化高效液相色譜法對其產生的DNJ進行分析，初步認為有望利用該菌株提高DNJ的產率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桑樹健康枝條采摘于瀏陽河畔（系統隨機抽樣）：桑葉粉末由湖南農業大學生物科學技術學院實驗室提供；土豆：市售。

1.2 主要儀器設備

CR21G高速冷凍智能離心機：日本日立公司；SWCJ-1B單人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；DK-8B電熱恒溫水浴鍋、GRX20干熱消毒箱、SYC-L1電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；TOMY SS-325濕熱滅菌鍋：Tomy KOGYO有限公司；AL204電子天平：梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；PHB-1筆型pH計：上海宇龍儀器有限公司；PYX-250Z-A振蕩培養箱：廣東韶關科力實驗儀器有限公司；1200Series高效液相色譜儀、ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：安捷倫科技有限公司；BCD-216ZDJ海爾冰箱：青島海爾股份有限公司。

1.3 試劑

DNJ（純度 99%）：Sigma公司；芴甲氧羰酰氯（9-fluorenylmethyl chloroformate，FMOC-Cl）（純度 98%）：上海共價化學科技有限公司；95%酒精、葡萄糖（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；四硼酸鈉（分析純）：中國醫藥（集團）上?；瘜W試劑公司；瓊脂粉末：北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；100萬單位注射用硫酸鏈霉素：華北制藥股份有限公司；甲醇（色譜純）：SK化工；冰乙酸（分析純）：天津市博迪化工有限公司。

1.4 培養基

分離與保藏培養基：土豆20%、葡萄糖2%、瓊脂1.8%～2.0%，自然pH，121℃滅菌25 min，滅菌后加入100 μg/mL硫酸鏈霉素。

發酵培養基：20%土豆、2%葡萄糖。自然pH，121℃滅菌25 min。

1.5 方法

1.5.1 內生真菌的分離培養和鑒定

參照梁嘉俊的方法[33]分離桑樹產生的內生真菌。用自來水沖洗直徑約0.5 cm的新鮮健康桑樹枝條，晾干后將其切成長度約1.5 cm數小段。在超凈工作臺上，依照下列過程按無菌操作方法對其進行表面滅菌：首先用75%的酒精漂洗3 min～5 min，無菌水沖洗3次～4次，再用0.1%升汞漂洗15 min，最后用無菌水沖洗5次。將已滅菌處理的桑樹枝條在已滅菌的培養皿中沿枝條縱向切成兩半（直徑0.5 cm左右、長度為1.5 cm左右的半圓柱形），用已滅菌的鑷子將其接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基平板上（將縱切面接觸培養基），然后將平板置于28℃恒溫培養箱中培養，每日觀察并檢查是否有雜菌污染；待與培養基接觸的縱切面邊緣有菌絲體長出，將菌絲體轉接到新的PDA培養基平板上進行分離純化；經過多次分離純化，將菌絲體接種于試管斜面，保存備用。

依照絲狀真菌的鑒定方法，根據菌落和孢子形態對菌絲體進行初步鑒定；然后將菌種寄到北京三博遠志公司對菌絲體進行精確鑒定。

為了確定桑樹枝條表面滅菌的徹底性以及超凈工作臺內空氣的潔凈度，試驗設計了一個內生真菌培養的對照組和空白組。對照組：直接將滅菌處理的桑樹枝條接種在PDA培養基平板上，再置于相同條件下進行培養；空白組：將PDA培養基平板蓋揭開并將PDA培養基平板暴露在空氣中一段時間后，再采用相同的方法進行培養。如果對照組的桑樹枝條周圍無任何菌絲體長出，空白組培養基上無菌落長出，則說明超凈工作臺內空氣潔凈度較高，桑樹枝條表面滅菌徹底，所分離到的菌是桑樹枝條內生菌，而不是桑樹枝條表面的附生菌。

1.5.2 菌種發酵試驗

參照何佳等的方法[34]分離桑樹產生的內生真菌。菌種發酵試驗分為3組：試驗組、對照組以及空白組。試驗組：共兩組，一組將不加入桑葉粉末的PDA培養基進行滅菌后，接種已鑒定菌種進行搖瓶液體發酵；另一組將按料液比1∶30（g/mL）加入桑葉粉末的PDA培養基進行滅菌后，接種已鑒定菌種進行搖瓶液體發酵；兩組培養溫度均為28℃，發酵周期為7 d。對照組：將按料液比1∶30（g/mL）加入桑葉粉末PDA培養基進行滅菌后不接種菌種，與試驗組在同樣條件下發酵處理7 d?？瞻捉M：將PDA培養基發酵液滅菌后，與試驗組在同樣條件下發酵處理7 d。

1.5.3 內生真菌的液體培養物的處理

首先將搖瓶發酵液在10 000 r/min下離心10 min，取上清液于容量瓶中；然后將20 mL 80%乙醇與沉淀混勻，離心10 min，取上清液于容量瓶中；再將20 mL水與沉淀混勻，離心10 min，取上清液于容量瓶中，定容至刻度，備用。

1.5.4 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）條件

1.5.4.1 標準溶液的配制

精確稱取5 mg DNJ標準品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為0.5 mg/mL的DNJ樣品對照溶液。

1.5.4.2 DNJ衍生化

參考唐靜等的方法[35]處理DNJ。取100 μL DNJ樣品對照溶液（或140 μL發酵液提取液）于1.5 mL的離心管中，加入0.4 mol/L的硼酸鹽緩沖液（pH=8.5）169 μL 與10 mmol/L 的 FMOC-Cl乙腈溶液 250 μL，混勻后于30℃恒溫水浴20 min，然后加入1%醋酸溶液66 μL，用水定容，再于 10 000 r/min 離心 3 min（10℃），取上清液過膜，用于HPLC檢測。

1.5.4.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAXEclipseXDBC18（4.6mm×150mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%冰醋酸（55∶45，體積比），流速：0.8 mL/min，柱溫：30℃；檢測波長：265 nm。

1.5.5 DNJ目標峰的確定

分別吸取100、150 μL DNJ樣品對照溶液，按照1.5.4.2的方法配置出不同濃度DNJ衍生樣品對照溶液，同時，配置無DNJ的單獨衍生劑樣品對照溶液；分別進樣DNJ衍生樣品對照溶液與衍生劑樣品對照溶液，從而確定DNJ目標峰位置。

1.5.6 標準曲線制備

根據單因素試驗，分別精確吸取DNJ樣品對照溶液 1、3、5、7、9 μL（根據單因素試驗設計），按照 1.5.4.2的方法進行衍生化反應，進樣測定DNJ含量，做出標準曲線。

1.5.7 穩定性試驗

取同一DNJ樣品溶液，衍生化后置于4℃冰箱中保存 2、4、6、12、24 h（根據單因素試驗設計）后，進樣檢測并記錄出峰的保留時間及峰面積，并以峰面積的自然對數計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.5.8 HPLC檢測發酵液中的DNJ

將發酵提取液按照1.5.4.2進行衍生化反應，每次準確吸取20 μL進樣檢測，用外標法計算DNJ含量。

2 結果與分析

2.1 內生真菌的分離及鑒定結果

桑樹枝條內生真菌菌絲生長圖見圖1。

圖1 桑樹枝條內生真菌菌絲生長圖Fig.1 The growth of endophyte mycelium in mulberry branch

桑樹枝條內生真菌菌絲外觀圖見圖2。

圖2 桑樹枝條內生真菌菌絲外觀圖Fig.2 The appearance of endophyte mycelium in mulberry branch

由圖1和圖2可知，試驗組桑樹枝條一端生成的菌落為內生真菌且為單一菌落。

菌種被寄至北京三博遠志公司進行鑒定，其結果如表1所示。

由表1可知，從桑樹中分離的內生真菌與Hy－poxylon sp.SUT242具有較高的同源性，其可能屬于Hypoxylon的一個種。

表1 內生真菌的鑒定結果Table 1 Identification results of endophytic fungi

2.2 DNJ目標峰的確定結果

DNJ目標峰確定的HPLC圖譜見圖3。

圖3 DNJ目標峰確定的HPLC圖譜Fig.3 The determinate HPLC chromatogram of DNJ target peak

通過對比圖3中3個色譜圖，含150 μL DNJ衍生樣品對照溶液在16.5 min左右出現的色譜峰的峰高與峰面積比含100 μL DNJ衍生樣品對照溶液在16.5 min左右出現的色譜峰高且大，而27.5 min左右出現的色譜峰較??；不含DNJ的FMOC-Cl樣品對照溶液只在27.5 min左右出現一個色譜峰，且峰高和峰面積比含DNJ的兩個在27.5 min左右出現的峰高且大，確定此峰為衍生劑峰，從而確定圖3中a、b色譜圖16.5 min左右出現的色譜峰為目標峰，即所需要的DNJ的色譜峰。

由于本試驗采用FMOC-Cl柱前衍生高效液相色譜法，衍生劑FMOC-Cl是熒光物質且在紫外－可見光區域具有吸收，其在HPLC檢測中能夠被檢測出，因此，圖3中a、b兩個色譜圖存在兩個色譜峰。

2.3 DNJ標準曲線

圖4為DNJ的標準曲線，曲線方程為y=215.14x+103.08，相關系數為R2=0.995 7，表明具有良好的線性關系，符合試驗要求。

圖4 DNJ標準曲線Fig.4 The standard curve of DNJ

2.4 穩定性試驗結果

穩定性試驗結果見表2。

表2 穩定性試驗結果Table 2 Results of stability experiment

由表2可知，采用FMOC-Cl柱前衍生化高效液相色譜法檢測出的DNJ峰面積的RSD為0.32%，表明FMOC-Cl柱前衍生化后溶液在24 h內是穩定的。

2.5 樣品測定結果

試驗樣品中DNJ含量測定結果見表3。

由表3中可知，空白組中未檢測出DNJ含量，對照組中DNJ的平均含量為2.987 μg/mL，試驗組中菌種發酵液中未檢測出DNJ的含量，菌種和桑葉粉末發酵液中DNJ的平均含量為3.485 μg/mL，較對照組中DNJ含量高。由此可知該菌種自身無法產生DNJ物質，推測其可將桑葉中的相關物質代謝轉化為DNJ。試驗樣品中DNJ含量測定色譜圖見圖5。

表3 試驗樣品中DNJ含量測定Table 3 The contents of DNJ in experimental samples

圖5 試驗樣品中DNJ含量測定色譜圖Fig.5 The DNJ content determination chromatograms in experimental samples

由圖5a可知，在16 min～17 min之間未出現DNJ目標峰，這是由于PDA液體培養基中不含DNJ物質；在27 min后出現了兩個較高的峰，其原因可能為FMOC-Cl不穩定，在水溶液中水解成在檢測條件下存在熒光吸收的FMOC-OH。FMOC-OH出峰的保留時間與衍生劑FMOC-Cl的相近，影響衍生劑FMOC-Cl出峰時間的判斷，對試驗具有干擾作用。

由圖5b可知，在16 min～17 min之間出現DNJ目標峰，但此峰存在拖尾現象，并且整個檢測過程中出現許多雜峰，其原因為桑葉粉末中物質種類較多，經發酵處理后，許多物質溶解至發酵液中，且發酵液未經純化處理。

由圖5c可知，在16 min～17 min之間未出現DNJ目標峰，這是由于菌種發酵液中不含DNJ，說明該菌株自身無法產生DNJ。

由圖5d可知，在16 min～17 min之間出現了DNJ目標峰，此峰無拖尾現象，但整個檢測過程中出現了許多的雜峰，其原因為桑葉粉末中物質種類較多，經過發酵處理后，菌種代謝產生的其他物質，溶解到了發酵液中，且發酵液未經純化。

3 討論

試驗表明，檢測滅菌效果和選擇表面滅菌的最佳條件對分離內生真菌具有重要的作用。本試驗設計了一個對照組檢測滅菌效果，但其不夠嚴密，因為如果殺菌強度未達到殺死組織內全部內生真菌的程度，內生真菌仍舊會長出，這將會誤判殺菌強度不足，而表面殺菌強度越強，表皮下滅菌層則越厚，能夠分離到的內生真菌越少，生存在更深層、未被殺死的內生真菌需要更長的培養時間穿越殺菌層，生長到植物材料表面。

4 結論

本試驗對桑樹內生真菌及其對桑葉粉末產生DNJ的效果進行了初步分析，得出初步結論：從桑樹枝條中分離出來的內生真菌與Hypoxylon sp.SUT242具有較高的同源性，其可能屬于Hypoxylon的一個種；其在PDA培養基中不能自身產生DNJ物質，但能將桑葉中的某些物質轉化成DNJ。

目前國際市場對桑葉提取物供不應求[36]，實驗室分離檢測桑樹內生真菌的操作不夠成熟。經研究發現，試驗可將制備的真菌誘導子加入培養的桑葉愈傷組織中，觀察其是否能夠誘導愈傷組織產生DNJ物質，或者將制備的桑葉懸浮細胞與內生真菌共同培養，研究其與DNJ積累的關系。桑樹內生真菌的分離檢測及其與DNJ的積累關系仍有待進一步研究。