非預包裝食品中沙門氏菌快速檢測方法的建立

王麗，石曉麗，楊桂娥

（包頭市食品藥品檢驗檢測中心，內蒙古包頭014060）

沙門氏菌（Salmonella）在我國乃至全球范圍內細菌性食物中毒中占首位，可致腸熱癥、慢性腸炎、食物中毒等[1]，人一旦攝入含有大量沙門氏菌（106CFU/g～107CFU/g）的食品，就會引起食物中毒導致的胃腸炎、傷寒和副傷寒。沙門氏菌的傳播媒介多為肉、蛋及其制品，且在與此類食品接觸或食品從加工到出售的過程中都易發生污染[2]，因此沙門氏菌的檢測對食品安全非常重要。

目前食品中沙門氏菌的檢測方法主要依據是國家標準方法GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》，該法耗時較長，過程繁瑣，檢測靈敏度偏低，且易受技術人員操作水平和經驗的影響[3-6]，這些弊端使食品安全監管的時效性降低。近年來，為彌補傳統國家標準方法檢測周期長的不足，各種快速檢測方法不斷涌現，如認可度較高的實時熒光PCR法、生物質譜法等[7-14]，而這些方法對儀器有著較高的要求，其普及性并不高。

本研究利用PCR分子層析檢測方法，使用常規增菌液增菌，通過對不同基質的非預包裝食品的大量試驗與結果數據分析，對比傳統國標檢測方法的特異性和靈敏度，探索出一個區別于傳統檢測方法的有效且快速的沙門氏菌檢測方法。該方法樣品前處理步驟少，使用的擴增儀較普通，較大程度地提升了該方法的可操作性及普及性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

腸炎沙門氏菌 CICC21513（Salmonella enteritidis）、大腸埃希氏菌CICC10389（Escherichia coli）：中國工業微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。

1.1.2 培養基和試劑

緩沖蛋白胨水、四硫磺酸鈉煌綠增菌液、改良緩沖蛋白胨水（modified buffered peptone water，mBPW）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、六水氯化鎂、亞硫酸鉍瓊脂：北京陸橋技術股份有限公司；沙門氏菌顯色培養基：上海科瑪嘉微生物技術有限公司；沙門氏菌PCR分子層析測試盒[15-16]（包括1.5 mL裝有預處理試劑的核酸提取管、緩沖液Buffer B、50 μLPCR試劑管和掌上型的層析卡盒）：上海美凱純生物科技有限公司。

1.1.3 儀器和設備

恒溫培養箱（PR505750R-CN）、水浴培養箱（TSCOL35）、PCR 擴增儀（power pac basic）：賽默飛世爾科技公司；立體壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-100SII）：上海博訊實業有限公司；金屬浴加熱裝置（TMS-300）：杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 試驗方法的研究

1.2.1 選取的樣品來源

本研究中非預包裝食品樣品本底采樣于不同超市和市場的散裝售賣點。普通基質樣品直接檢測。復雜基質樣品是將涼菜類樣品本底在室溫下放置2 d，待其自然腐敗后進行檢測，以模擬自然界的復雜微生物環境，涼菜類檢測樣品均為放置2 d后自然腐敗的樣品；生鮮蛋類則挑取了粘附有禽類糞便的樣品。

1.2.2 沙門氏菌檢測

沙門氏菌檢測方法流程見圖1。

圖1 沙門氏菌檢測流程Fig.1 Salmonella detection process

1.2.3 檢測過程

1.2.3.1 樣品處置

非冷凍的易腐樣品若不能及時檢測，應置于2℃～5℃冰箱保存，在24 h內檢測。冷凍樣品應在45℃以下不超過15 min或2℃～5℃不超過18 h解凍，若不能及時檢測，應置于-10℃～-20℃保存。

1.2.3.2 樣品制備及增菌

1）普通基質樣品

稱取25g（mL）樣品，放入盛有225mLBPW增菌肉湯的無菌均質袋或均質杯內，8 000 r/min～10 000 r/min均質1 min～2 min，制成樣品勻液。將制備好的樣品放于（36±1）℃培養箱中培養 8 h～18 h。

2）復雜基質樣品

稱取25 g（mL）樣品，放入盛有225 mL mBPW增菌肉湯的無菌均質袋或均質杯內，8000r/min～10000r/min均質1 min～2 min，制成樣品勻液。將制備好的樣品放于（36±1）℃培養箱中培養 8 h～18 h。

1.2.3.3 核酸的提取及擴增

取培養好的增菌肉湯（普通食品500 μL，香辛料樣品50μL）加到已經恢復到室溫的1.5mL核酸提取管中蓋好，上下顛倒混勻內容物或渦旋混勻5 s，（95±2）℃金屬浴或水浴加熱滅活10 min，取出后10 000 r/min離心1 min，室溫冷卻10 min，取出后和下一步加樣前不要搖動[注：滅活和未滅活的核酸提取管可以在（-20±2）℃保藏一周]。

從已經冷卻的核酸提取管中取5 μL上清液加到已解凍的PCR試劑管中，可室溫解凍（10±1）min，并立即使用，且為避免PCR管之間交叉污染，只在加樣時打開PCR管，加樣后立即關閉，10 000 r/min離心10 s，將PCR試劑管放入擴增儀，并運行相應程序（沙門氏菌普通食品用SS，香辛料樣品用SS SPICE）。擴增程序設置見表1。

表1 沙門氏菌擴增程序Table 1 Salmonella amplification program

1.2.3.4 層析卡盒檢測及結果判定

程序運行結束，冷卻后加入4滴緩沖液（buffer B），用200 μL移液槍將PCR擴增管內全部擴增物轉移到層析卡加樣窗內，等待（2±0.25）min再加4滴buffer B至加樣窗內，等待（1±0.25）min，拉動檢測卡盒上的開關，觀察檢測結果。若出現一條紅色質控線，表示層析卡盒工作正常；若質控線和檢測線都出現表示沙門氏菌屬陽性；而只出現質控線，則表示為陰性，結果如圖2所示。

圖2 層析卡盒檢測結果判定Fig.2 Chromatographic card box detection results determination

2 結果與分析

2.1 普通基質食品中沙門氏菌的檢測結果與分析

2.1.1 面食制品

取20批不同種類的面食制品（蛋糕、夾心面包、果仁餅干、饅頭、果條、玉米餅、膜片、油餅）各25 g，分別加入225mLBPW增菌肉湯，每批樣品中分別添加1mL不同濃度（10-4～10-7）的沙門氏菌陽性菌液，于（36±1）℃培養18 h后分別用國標法GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》和PCR分子層析法同時檢測，將不同濃度的陽性菌液分別涂布于沙門氏菌顯色培養基，于（36±1）℃培養24 h后計數。結果見表2、表3。

表2 不同濃度沙門氏菌陽性菌懸液計數結果Table 2 The count results of different concentrations of Salmonella positive bacteria suspension

由表3可知，20批不同種類的面食制品比較國標法和PCR分子層析法檢測沙門氏菌，添加陽性菌量濃度為10-4和10-5時，陽性菌數量偏多，兩種方法均檢出沙門氏菌。當添加陽性菌量濃度為10-6和10-7時，陽性菌數量偏少或極少，PCR分子層析法檢測結果為檢出，而國標法則為未檢出，由此表明PCR分子層析法比較國標法有更低的檢出限和更高的靈敏度。

表3 20批不同種類面食制品比較國標法和PCR分子層析法的檢測結果Table 3 The comparation of the detection results between national standard method and PCR molecular chromatography on 20 batches different types pasta products

2.1.2 乳制品

取20批不同種類的乳制品（生牛乳、生羊乳、奶酪、奶豆腐）25 g（mL），加入 225 mL BPW 增菌肉湯，每批樣品中分別添加1 mL不同濃度（10-4～10-7）的沙門氏菌陽性菌液，于（36±1）℃培養18 h后分別用國標法和PCR分子層析法同時檢測，結果見表4。

表4 20批不同種類乳制品對比國標法和PCR分子層析法的檢測結果Table 4 The comparation of the detection results between national standard method and PCR molecular chromatography on 20 batches different types dairy products

由表4可知，20批不同種類的乳制品比較國標法和PCR分子層析法檢測沙門氏菌，由于生鮮乳樣品的基質相對復雜，添加陽性菌量濃度為10-5時，國標法未檢出沙門氏菌，PCR分子層析法則同時在添加陽性菌濃度為10-5、10-6和10-7的樣品中檢出沙門氏菌，由此表明PCR分子層析法的抗干擾性更強，檢測靈敏度更高。

2.1.3 肉制品

取20批不同種類的熟肉制品（豬蹄、雞翅、羊蹄、紅腸、牛肚）25 g，加入225 mL BPW增菌肉湯，每批樣品中分別添加1 mL不同濃度（10-4～10-7）的沙門氏菌陽性菌液，于（36±1）℃培養18 h后分別用國標法和PCR分子層析法同時檢測，結果見表5。

由表4和表5試驗結果可知，PCR分子層析法測定基質相對復雜的樣品時，較國標法有更好的抗干擾能力，且檢測靈敏度更高，可達到1 CFU/mL～10 CFU/mL的陽性菌添加濃度。

表5 20批不同種類肉制品對比國標法和PCR分子層析法的檢測結果Table 5 The comparation of the detection results between national standard method and PCR molecular chromatography on 20 batches different types meat products

2.1.4 PCR分子層析法檢測沙門氏菌的特異性研究

將沙門氏菌檢測中對其干擾和競爭最多的大腸埃希氏菌作為特異性實驗的干擾菌株，取1 mL濃度為10-5的沙門氏菌菌懸液，加入BPW增菌肉湯，同時分別加入 1 mL 不同濃度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5）的大腸埃希氏菌的菌懸液于（36±1）℃培養18 h后用PCR分子層析法檢測，結果見表6。

表6 PCR分子層析法檢測沙門氏菌的特異性試驗結果Table 6 Detection of Salmonella specific experiment results by PCR molecular chromatography

由表6可知，在沙門氏菌濃度較低的情況下，不斷增大干擾菌大腸埃希氏菌菌懸液的濃度，最大的添加濃度可到達10-2，PCR分子層析法均檢出沙門氏菌，表明PCR體系中存在大量其他干擾菌株的DNA時，并不會影響檢測結果，可見PCR分子層析法具有較強的特異性和排他性。

2.2 復雜基質與普通基質食品中沙門氏菌的檢測結果與分析的比較研究

2.2.1 涼菜類和生鮮蛋類

分別取20批不同種類的涼菜（面筋涼皮、煮花生、腐竹銀耳、蕨根粉、豆皮）和20批生鮮蛋（雞蛋、鴨蛋、鵪鶉蛋且蛋殼表面附帶原糞）25 g，加入225 mL BPW增菌肉湯，對于微生物環境較為復雜的食品樣品基質，試驗中增大了陽性菌菌懸液的添加濃度，以增強沙門氏菌的競爭力。即每一批樣品中分別添加1 mL濃度為 10-2～10-7的沙門氏菌陽性菌菌懸液，于（36±1）℃培養18 h后，分別用國標法和PCR分子層析法檢測，結果見表7、表8。

表7 20批不同種類涼菜對比國標法和PCR分子層析法的檢測結果Table 7 The comparation of the detection results between national standard method and PCR molecular chromatography on 20 batches different types cold dishes

由表7可知，用國標法和PCR分子層析法同時檢測20批不同種類的涼菜中的沙門氏菌，當添加陽性菌濃度為10-2時，兩種方法均可檢出沙門氏菌，添加陽性菌濃度降為10-3時，國標法未檢出沙門氏菌，而PCR分子層析法檢出了沙門氏菌。可見對于基質較復雜的食品，兩種方法的檢測靈敏度明顯下降。

表8 20批不同種類生鮮蛋對比國標法和PCR分子層析法的檢測結果Table 8 The comparation of the detection results between national standard method and PCR molecular chromatography on 20 batches different types fresh eggs

由表8可知，用國標法和PCR分子層析法同時檢測20批不同種類的生鮮蛋中的沙門氏菌，與涼菜相比生鮮蛋類樣品基質的微生物環境更為復雜。當添加陽性菌濃度為10-2時，國標法未檢出沙門氏菌，而PCR分子層析法檢出了沙門氏菌。表明樣品基質的微生物環境較復雜時，干擾菌對沙門氏菌的抑制和競爭作用增強，使得檢出率和靈敏度均有降低。

2.2.2 增菌液的優化研究

為降低復雜基質樣品本底對測定結果的干擾，用基質微生物環境較復雜的20批生鮮蛋作為樣本，分別在其增菌液BPW中加入六水氯化鎂、碳酸鈣以及檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉，進行了比對試驗。比對結果顯示，在BPW中加入六水氯化鎂的增菌液（mBPW），對生鮮蛋樣本的增菌效果較理想，可使PCR分子層析法的檢測靈敏度有顯著提高。結果見表9。

表9 20批生鮮蛋增菌液優化前后PCR分子層析法檢測結果Table 9 The comparation of the detection results on 20 batches fresh eggs before and after optimization of increase microbial liquid by PCR molecular chromatography

由表9可知，使用優化后的增菌液mBPW，PCR分子層析法檢測陽性菌添加濃度由10-2降低至10-4，檢測靈敏度得到提高，相比優化前提高了100倍。對于基質較復雜的食品可以采用PCR分子層析法結合改良增菌液進行檢測。

3 討論與結論

沙門氏菌的種類繁多，生存力強，在20℃以上即可大量繁殖。隨著食品售賣方式的多樣化，尤其對于基質相對復雜的非預包裝食品來說，對其生物污染的及時檢測顯得尤為重要，如何快速準確地檢出污染微生物是預防和控制食品安全問題的重要環節。

傳統的檢測技術在沙門氏菌的分離過程中存在一定的不確定性，檢驗步驟耗時較長，易受環境和微生物活性影響，且對檢驗人員的檢驗技術和經驗均有較高要求，不能很好地與食品安全所需的“及時準確”相適應。

目前的沙門氏菌檢驗技術，包括分子生物學技術、生物傳感器檢測技術、質譜檢測技術等，一是對人員操作能力有要求，二是儀器操作相對復雜，三是樣品處理復雜。因此，對沙門氏菌的快速檢測技術和風險監控技術的開發和應用研究，成為食品安全檢測發展的重要方向[17-22]。

本研究相比其他快速檢測方法，具有較高特異性和靈敏度的優勢，且準確性和穩定性也較好。應用PCR分子層析技術檢測沙門氏菌有其獨特的優勢，一是樣品前處理步驟少，不需要樣品純化和復雜的DNA提取，操作簡單，不易受環境影響；二是檢測靈敏度可達到陽性菌最低添加濃度10 CFU/mL；三是時效性大大提高，PCR分子層析法檢測周期比傳統國標方法檢測周期快了6倍左右，彌補了沙門氏菌國標檢測方法周期長的不足，提高了沙門氏菌檢測的時效性；四是本方法所使用的擴增儀是食品檢測實驗室常規配置的儀器，價格不高，便于方法的普及推廣。