普洱茶改善高脂飼料飼喂大鼠的胰島素抵抗作用

杜恩菊，張譯丹，才讓卓瑪，陳婷婷，張鑫璐，秦清洲，孫康函，馮偉，王雪青，*，宋文軍，白小麗，李長文

（1.天津市食品與生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300134；2.云南天士力帝泊洱生物茶集團有限公司，云南普洱665100）

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是由多種原因引起的機體中單位胰島素生物功能下降，只有通過多分泌胰島素才能實現維持血糖的穩定，而這樣會使血液中的胰島素濃度升高，導致其靶組織，如肝臟、脂肪組織及骨骼肌等對胰島素的敏感度下降從而產生抗性，當這種代償性分泌能力達到極限也不足以控制血糖時，就會發展成為II型糖尿病。胰島素抵抗是II型糖尿病的主要發病機制。現代生活方式導致糖尿病的患病率己呈現逐年上升趨勢，其中II型糖尿病占整個糖尿病比例的93.7%以上[1-2]，對人類健康的危害僅次于心腦血管病，是現代疾病中的第二大殺手。因此，如何提高機體對胰島素的敏感性，減輕胰島素抵抗已成為治療和預防II型糖尿病及其并發癥的重要手段。

目前改善胰島素抵抗的藥物，如曲格列酮、口比格列酮、羅格列酮等噻唑烷二酮類化合物（thiazolidinediketones，TZDs），均具有誘導機體肥胖、產生肝毒等副作用。因此，從天然植物中尋找一種安全有效的能改善胰島素抵抗的保健食品或飲品具有十分重要的意義。據報道，一些天然植物，如普洱茶，具有減肥降脂、預防動脈硬化、降血糖等多種功效[3]，長期以來被用于減肥降脂和輔助治療糖尿病。然而關于普洱茶改善高脂飼料飼喂大鼠的胰島素抵抗的作用研究甚少。本試驗選用正常大鼠為實驗對象，每天飼喂高脂飼料以模擬正常人群的非健康飲食狀況，用普洱茶的熱水浸提物對大鼠進行灌胃干預，觀察普洱茶對大鼠的體重、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、胰島素（insulin，INS）及肝糖原水平的影響，及其對正常大鼠肝臟中葡萄糖激酶（glucose kinase，GK）、肝糖原合成酶-2（glycogen synthetase 2，Gys-2）、葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6pc）、胰島素受體（insulin receptor，INSR）和脂肪組織中葡萄糖轉運蛋白-4（glucose transporters-4，GLUT-4）、過氧化物酶體增殖劑激活受體-γ（peroxisome proliferators activated receptorsγ，PPAR-γ）表達水平的影響，以期闡明普洱茶改善大鼠胰島素抵抗的作用與機制，為進一步開發普洱茶成為預防和治療與胰島素抵抗相關疾病的功能性飲品提供理論和試驗支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普洱茶熱水浸提物：云南天士力帝泊洱生物茶集團有限公司。具體操作按照茶水質量比1∶10，水溫度90℃，浸提30 min，二次，減壓蒸餾，噴霧干燥成粉，對得到的普洱茶浸提物成粉進行成分分析，其中茶色素約占49.44%（其中茶褐素占47.32%）、蛋白質25.75%和多糖16.74%。

基礎飼料配方為（質量百分比）：玉米36.9%、麩皮15.5%、小麥15.5%、豆粕15.5%、魚粉4.5%、維生素0.1%、礦物質添加劑2.5%、花生餅9.5%。高脂飼料配方為：基礎飼料59.25%、全脂奶粉2%、豬油20%、蔗糖10%、蛋黃粉8%、酵母粉0.5%，冰凍儲存。大鼠基礎及高脂飼料：中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，生產許可證編號：SCXK-軍2002-018。

染料法實時熒光定量試劑盒、TRIZOL Reagent、M-MLV Fist Strand Kit、核糖核酸酶抑制劑、瓊脂糖分子：美國 Life Technologies公司；DNA Ladder 2000、DEPC處理水：上海依科賽生物制品有限公司；Gene Green核酸染料：天根生化科技（北京）有限公司；50×TAE：北京索來寶生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

成年雄性SD大鼠SPF級，雄性，體質量160g～170 g，共50只：中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，生產許可證編號：SCXK-軍2012-0004。

1.3 儀器與設備

UV-2550/2450紫外分光光度計：日本島津公司；3-18k型高速冷凍離心機：德國SIGMA公司；UV-1紫外透射分析儀：珠海黑馬醫學儀器有限公司；DYY-4C電泳儀：北京六一儀器廠；chemiDocTmXRS凝膠電泳成像儀、T100Tm熱循環儀：美國 BIO-RAD；StepOnePlusTm實時熒光PCR儀：美國Applied Biosystem公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 動物分組及給藥

按照蘇靜靜等的方法，將SD大鼠飼養、分組和給藥[4]。

1.4.2 樣本收集

試驗結束時，各組大鼠禁食24 h，眼球靜脈取血。4℃，3 000 r/min離心10 min，取血清，放入-80℃凍藏待測。肝臟和附睪脂肪組織處理和收集方法參見文獻[4]。

1.4.3 脂肪系數的測定

式中：m1為睪脂總數，g；m2為大鼠體重，g。

1.4.4 大鼠血清中FBG、肝糖原和INS水平及胰島素敏感指數（insulin sensitive index，ISI）的測定

FBG的測定：參考文獻[5]，具體方法按照產品說明書操作。

肝糖原水平的測定：測定原理同蒽酮法，具體方法按照產品說明書操作。

INS水平的測定：參考文獻[6]采用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法，具體方法按產品說明書操作。根據所測得的FBG和INS，按照下列公式計算出ISI，判斷是胰島素分泌不足還是胰島素抵抗。

胰島素敏感指數＝ln[1/（FBG×INS）]

式中：FBG為空腹血糖的濃度，mmol/L；INS為胰島素濃度，mIU/L。

1.5 肝臟中GK、Gys-2、G6pc及INSR和附睪脂肪中PPAR-γ、GLUT-4表達水平測定

1.5.1 組織總RNA提取

取凍存組織50 mg～100 mg，液氮速凍并研磨成粉；取TRIZOL試劑1.0 mL溶解組織粉末，制成TRIZOL組織懸液，室溫（25℃）靜置20 min；加氯仿0.2 mL，混勻、室溫（25℃）靜置 5 min；4℃離心，12 000 r/min，15 min；取上層水相 400 μL，加等體積異丙醇，靜置15 min；4 ℃離心，12 000 r/min，10 min；棄上清，沉淀加冰冷75%乙醇（不含RNA酶的無核酸酶水配制，4℃預冷備用）1.0 mL；4℃離心，8 000 r/min，5 min；棄上清，沉淀空氣干燥20 min；沉淀加經焦碳酸二乙酯處理的滅菌超純水40 μL，溶解，制得總RNA溶液。

1.5.2 總RNA逆轉錄成cDNA

1.5.2.1 RNA完整性的測定

取DEPC水配制的1倍TAE緩沖液（1×TAE）[由三羥甲基氨基甲烷、乙酸和乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）組成]制備 1%瓊脂糖凝膠，將提取的總RNA溶液取2 μL于1.5 mL EP管中，加298 μL DEPC水（稀釋150倍），分別加樣，電壓100 V，電流50 mA，電泳30 min，紫外透射儀觀察總RNA，當清晰的28S和18S RNA條帶出現，前者的強度大于后者，驗證所提取的總RNA具有完整性。

1.5.2.2 RNA純度及含量的測定

測定所提取總RNA的OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，為滿足用于cDNA合成的純度。RNA的含量為：總RNA濃度/（μg/μL）＝OD260值×0.04×稀釋倍數。

1.5.2.3 逆轉錄

無核酸酶的0.2 mL聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）管冰浴并依次加入 1 μL Oligo（dT）20（50 μmol/L），1 μL 總 RNA，1 μL 10 mmol/L 脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP），加DEPC水至12 μL；混合物在65℃加熱5 min后，冰冷2 min后，加4 μL 5倍體積的第一鏈合成緩沖液，2 μL 0.1 mol/L 二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），1 μL RNaseOUTTm核酸酶抑制劑；在離心管中輕輕將各種成分混合，37℃下孵育 2 min；加入 1 μL（200 U/μL）M-MLV逆轉錄酶，混勻。37℃孵育50 min，70℃加熱15 min以終止反應，-20℃保存備用。

1.5.3 實時熒光PCR檢測肝臟中GK、Gys-2、G6pc及INSR和附睪脂肪中PPAR-γ、GLUT-4表達水平

大鼠肝臟中 GK、Gys-2、G6pc、PPAR-γ、GLUT-4、PPAR-γ及β-肌動蛋白基因序列設計引物見表1。

1.5.3.1 引物設計

根據表1，β-肌動蛋白作為內參，所有引物均由美國Applied Biosystem公司設計及合成。取組織RNA原液進行5倍系列的稀釋50～5-4，運用StepOnePlusTm實時熒光 PCR 分析儀對 β-肌動蛋白、GK、Gys-2、G6pc、PPAR-γ及GLUT-4基因進行擴增，采用自動分析軟件繪制 GK、G6pc、Gys-2、INSR、PPAR-γ、GLUT-4 及β-肌動蛋白標準曲線，相關系數大于0.99且擴增效率在 100%～110%。同時，GK、G6pc、Gys-2、INSR、PPAR-γ、GLUT-4及β-肌動蛋白的溶解曲線出現單特異峰且擴增曲線，無引物二聚體及非特異性擴增產物出現。確定 GK、G6pc、Gys-2、INSR、PPAR-γ、GLUT-4 及 β-肌動蛋白引物合適，能夠用于實時熒光PCR的基因表達差異的檢測。

表1 β-肌動蛋白、GK、Gys-2、G6pc、INSR、PPAR-γ 和GLUT-4特異性引物Table 1 The specific primers of β-actin，GK，Gys-2，G6pc，INSR，PPAR-γ and GLUT-4

1.5.3.2 實時熒光RCR擴增

1）GK和G6pc：取1.5.3.1逆轉錄反應產物于20 μL反應體系中進行實時熒光PCR反應。反應體系組成如下：10 μL SYBR Select Master Mix，cDNA 1 μL，上、下游特異性引物各0.6 μL（5 μmol/L，美國Applied Biosystem 公司合成），7.2 μL DEPC。先 95℃預變性2 min，然后95℃15s、60℃1 min循環40次，結束反應。

2）Gys-2和INSR：取1.5.3.1逆轉錄反應產物于20 μL反應體系中進行實時熒光PCR反應。反應體系組成如下：10 μL SYBR Select Master Mix，cDNA 1 μL，上、下游特異性引物各 0.8 μL（5 μmol/L，美國 Applied Biosystem公司合成），7.4 μL DEPC。先95℃預變性2 min，然后 95 ℃15 s、60℃ 1 min循環 40次，結束反應。

3）PPAR-γ和GLUT-4：取1.5.3.1逆轉錄反應產物于20 μL反應體系中進行實時熒光PCR反應。反應體系組成如下：10μLSYBR Select Master Mix，cDNA 2 μL，上、下游特異性引物各0.6 μL（5 μmol/L），6.8 μL DEPC。先95℃預變性2 min，然后95℃15 s、60℃1 min循環40次，結束反應。

1.5.3.3 RNA相對含量的計算

用相對定量2-ΔΔCT法分析結果，用各個樣本的目的基因的CT值減去各個樣本的內參基因（β-actin）的CT值，得到ΔCT值；用ΔCT減去正常對照組的平均ΔCT值，得到ΔΔCT值。用2-ΔΔCT計算各個樣本目的基因的表達變化。

1.6 統計方法

所有試驗數據利用SPSS16.0統計軟件，處理結果用平均值±標準差表示，組間比較采用非參數Mann-Whitney檢驗，作顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 普洱茶對大鼠體重和脂肪系數的影響

普洱茶對大鼠體重和脂肪系數的影響見表2。

表2 普洱茶對大鼠體重和脂肪系數的影響Table 2 Effects of Pu’er tea on body weight and fat coefficient in rat

大鼠經12周的處理后，高脂對照組較正常對照組體重和脂肪系數極顯著上升（P<0.01），與高脂對照組相比，普洱茶低、中、高劑量組體重和脂肪系數顯著下降（P<0.05）。結果表明，在試驗劑量范圍內，普洱茶具有預防大鼠肥胖的作用且呈劑量依賴關系。

高脂飲食導致的肥胖，尤其是腹型肥胖是胰島素抵抗發生的主要病因[7]。腹內脂肪以體積增大的脂肪細胞為主，這種脂肪細胞對胰島素的敏感性大大減低，從而引起胰島素抵抗。普洱茶可以顯著地降低機體脂肪系數和體重[3-4]。本試驗結果表明，與正常對照組相比，高脂對照組的體重、脂肪系數顯著升高，而處理組大鼠體重和脂肪系數則顯著降低，這與Lee等研究結果一致[8]。

2.2 普洱茶對大鼠血清FBG、INS水平和ISI的影響

普洱茶對大鼠血糖、胰島素水平及胰島素敏感指數的影響見表3。

結果表明，與正常對照組相比，高脂對照組大鼠血糖水平顯著升高（P<0.01）。普洱茶低、中、高劑量組大鼠的血糖水平顯著低于高脂對照組（P<0.01）。同時，高脂對照組大鼠血清中胰島素水平較正常對照組顯著升高（P<0.01），與高脂對照組相比，普洱茶低、中、高劑量組分別降低12.57%、33.01%及43.45%，特別是中、高劑量組極顯著降低（P<0.01），而普洱茶低、中、高劑量組大鼠胰島素敏感指數分別升高9.88%、46.59%及24.18%（P<0.05）。這表明高脂對照組大鼠產生了胰島素抵抗，胰島素敏感指數降低，從而導致血糖含量升高，提示普洱茶可以改善高脂飼料飼喂大鼠胰島素抵抗的作用。

表3 普洱茶對大鼠FBG和INS水平及ISI的影響Table 3 Effects of Pu’er tea on FBG，INS and ISI in rats

有研究顯示，普洱茶茶色素可降低單純性肥胖大鼠的空腹胰島素，調節血脂，提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗[9-10]。本文采用的普洱茶的熱水浸提物，其主要成分是茶色素（49.44%）。茶色素是發酵茶在其特殊的工藝制備過程中形成的，并賦予普洱茶特殊的風味，影響著產品的質量。這與本試驗結果一致。普洱茶能夠通過降低大鼠體質量和腹部脂肪質量，有效地改善大鼠的胰島素抵抗，從而使大鼠血糖維持在較低水平[3]。因此，普洱茶可以改善高脂飼料喂養大鼠胰島素抵抗，從而預防II型糖尿病和與胰島素抵抗相關疾病的發生。

2.3 普洱茶對大鼠肝糖原含量的影響

肝臟中的肝糖原相當于儲能物質，能夠維持血液中血糖濃度平衡。當血糖充足時，肝糖原不分解。血糖升高時，在胰島素的作用下，促進血糖進入肝臟轉變為肝糖原，降低血糖。因此，肝糖原水平的高低反映了機體內血糖的平衡情況和肝臟的健康程度。普洱茶對大鼠血清中肝糖原水平的影響見圖1。

與正常對照組相比，高脂對照組肝糖原含量顯著降低，經普洱茶干預的低、中、高劑量組分別升高52.63%、62.28%及90.79%（P<0.01）。說明普洱茶可以顯著提高大鼠肝糖原的合成能力，從而有效的調節大鼠血糖水平。

2.4 普洱茶對大鼠肝臟中INSR、GK、G6pc、Gys-2和附睪脂肪組織中PPAR-γ、GLUT-4表達水平的影響

2.4.1 普洱茶對大鼠肝臟中INSR表達水平的影響

普洱茶對大鼠肝臟中胰島素受體表達水平的影響見圖2。

圖1 普洱茶對大鼠肝糖原水平的影響Fig.1 Effect of Pu’er tea on the level of hepatic glycogenin rats

圖2 普洱茶對大鼠肝臟INSR表達水平的影響Fig.2 Effect Pu′er tea on the expression level of INSR in the liver

高脂對照組大鼠肝臟中胰島素受體表達水平較正常對照組降低了32.12%（P<0.01）。與高脂對照組相比，普洱茶低、中、高劑量組大鼠胰島素受體表達水平分別升高了 75.97%、86.63%及 123.19%（P<0.05），特別是高劑量組胰島素受體表達水平極顯著降低（P<0.01）。表明普洱茶可以升高大鼠肝臟胰島素受體的表達水平，提高胰島素和胰島素受體的結合能力，降低血糖水平。

胰島素抵抗發病機制的受體水平基因突變包括胰島素受體前缺陷、受體水平缺陷和受體后缺陷。其中以受體和受體后水平最為重要[11-13]。本試驗結果表明，普洱茶能使INSR表達水平顯著升高。通過上調肝臟中INSR表達水平，增強INS作用信號的傳遞，從而改善胰島素抵抗狀態。王文祥等[9]研究表明，普洱茶可以顯著提高胰島素抵抗大鼠紅細胞胰島素高親和力受體數目，降低空腹血糖和胰島素水平。這與本試驗結果一致。

2.4.2 普洱茶對大鼠GK和G6pc表達水平的影響

普洱茶對大鼠肝臟中GK和G6pc表達水平的影響見圖3。

圖3 普洱茶對大鼠GK和G6pc表達水平影響Fig.3 Effect of Pu’er tea on the expression level of GK and G6pc in rats

試驗結果表明，與正常對照組相比，高脂對照組大鼠肝臟GK表達水平顯著降低（P<0.05），經過普洱茶干預后，普洱茶低、中、高劑量組GK水平分別升高11.91%、43.08%和61.56%，尤其中、高劑量組顯著升高（P<0.01）。同時，普洱茶各劑量組大鼠肝臟G6pc表達水平顯著低于高脂對照組，特別是高劑量組G6pc表達水平降低29.58%（P<0.01）。表明普洱茶可顯著升高高脂飼料飼喂大鼠肝臟中GK表達水平，降低G6pc水平，有效地促進葡萄糖轉變為6-磷酸葡萄糖，抑制糖異生，從而預防大鼠血糖水平的升高。

肝臟葡萄糖的利用和釋出分別依賴6-磷酸葡萄糖的合成與水解，這兩步方向相反的反應分別由GK和G6pc催化完成。在高熱量飲食引起的胰島素抵抗模型中，發現模型組肝糖原含量下降，葡萄糖激酶活性下降，葡萄糖-6-磷酸酶活性增加，肝臟葡萄糖輸出增多[14-15]。本試驗結果表明，普洱茶處理組大鼠肝臟中GK表達水平顯著升高，而G6pc表達水平則顯著降低。因此，普洱茶可以通過增加肝臟中GK表達水平，降低G6pc表達水平，有效地促進肝糖原的合成，抑制糖異生，從而改善肝臟胰島素抵抗。

2.4.3 普洱茶對大鼠肝臟中Gys-2表達水平的影響

普洱茶對大鼠肝臟Gys-2表達水平的影響見圖4。

圖4 普洱茶對大鼠Gys-2表達水平影響Fig.4 Effect Pu’er tea on the expression level of Gys-2 in rats

高脂對照組較正常對照組大鼠肝臟Gys-2表達水平顯著降低（P<0.01），表明高脂對照組大鼠肝糖原合成能力降低。與高脂對照組相比，普洱茶低、中、高劑量組Gys-2表達水平分別升高了36.95%、60.86%及85.93%（P<0.01）。該結果表明，普洱茶可以有效地升高Gys-2表達水平。Gys-2表達水平的提高能促進血糖進入肝臟合成肝糖原，從而降低血糖水平。

2.4.4 普洱茶對大鼠附睪脂肪組織中PPAR-γ和GLUT-4表達水平的影響

普洱茶對大鼠脂肪組織中PPAR-γ和GLUT-4表達水平的影響見圖5。

圖5 普洱茶對大鼠附睪脂肪組織中PPAR-γ和GLUT-4表達水平的影響Fig.5 Effect Pu’er tea on the expression level of PPAR-γ and GLUT-4 in rats

與正常對照組相比，高脂對照組PPAR-γ表達水平下降15.57%（P<0.05），普洱茶低、中、高劑量組較高脂對照組PPAR-γ水平顯著上升（P<0.05）。同時，高脂對照組大鼠脂肪組織GLUT-4表達水平較正常對照組降低24.56%（P<0.05），普洱茶低、中、高劑量組GLUT-4水平較高脂對照組分別升高31.35%、54.07%及96.71%（P<0.01）且呈劑量依賴關系。上述表明，普洱茶能夠升高大鼠脂肪組織PPAR-γ和GLUT-4的表達水平，有效改善大鼠胰島素抵抗，從而預防大鼠糖尿病的發生。

與糖代謝和脂代謝密切相關的PPAR-γ，常作為減肥和降糖的主要靶點之一。當激活PPAR-γ后，能夠增加肝細胞的INSR和GLUT-4的表達水平，從而提高胰島素敏感性[16-18]。本試驗結果表明，高脂對照組PPAR-γ表達水平較正常對照組顯著降低，而普洱茶處理組大鼠脂肪組織中PPAR-γ表達水平較高脂對照組顯著升高。顯示出普洱茶能夠通過提高PPAR-γ在脂肪細胞中的表達，增強機體胰島素敏感性。

GLUT-4表達異常是脂肪組織產生IR的主要原因。在脂肪細胞中有選擇性地過量表達GLUT-4可以增強和改善整體胰島素敏感性，而敲除脂肪細胞中的GLUT-4基因則會導致胰島素抵抗[19-20]。因此，葡萄糖轉運的主要轉運體GLUT-4在基因表達量發生減少時，可導致對葡萄糖攝取率的減少，進而導致胰島素抵抗的發生。本試驗結果表明，與正常對照組相比，高脂對照組GLUT-4表達水平顯著降低，而普洱茶處理組大鼠脂肪組織中GLUT-4表達水平較高脂對照組顯著升高。因此，普洱茶通過提高細胞外膜上的GLUT-4表達水平，增強脂肪細胞對葡萄糖的轉運和攝取，改善大鼠脂肪組織胰島素抵抗。另一方面普洱茶通過提高脂肪組織PPAR-γ表達水平，增強了GLUT-4表達水平。關于普洱茶對高脂飼喂動物組織GLUT-4基因表達的影響研究甚少。然而，有研究顯示，六堡茶可以通過上調GLUT-4基因的表達，改善3T3-L1脂肪細胞的胰島素抵抗[20]。

3 結論

普洱茶能降低大鼠體重、脂肪系數、空腹血糖及胰島素水平，提高高脂飼喂大鼠機體的胰島素敏感指數，改善胰島素抵抗。其作用機制為普洱茶能夠通過增加 GK、Gys-2、INSR、PPAR-γ 和 GLUT-4 表達水平以及降低G6pc表達水平，改善大鼠的胰島素抵抗狀態，有效地降低血糖水平。因此，普洱茶可作為預防和治療II型糖尿病和與胰島素抵抗相關疾病的潛在保健飲料。