番石榴葉總三萜改善糖尿病大鼠視網膜損傷的作用機制研究

張俏，羅影，劉學政

糖尿病病程延長可導致視網膜神經節細胞（retinal ganglion cell，RGC）凋亡甚至死亡，RGC 數量隨之減少［1-2］。RGC軸突形成視神經，RGC損傷會影響患者的視力［3］。因此，保護RGC 免受損傷對防治糖尿病視網膜損傷尤為重要。近年來中醫藥在防治糖尿病中具有較好的效果［4-5］。番石榴葉總三萜（total triterpenoids in guava leaves，TTPGL）為番石榴葉的提取物，具有明顯的降低血糖及抑制炎癥反應的作用，對糖尿病的防治具有較好的療效［6-7］。但TTPGL 對糖尿病視網膜損傷的影響目前尚不清楚。因此，本研究擬應用TTPGL 對糖尿病大鼠進行灌胃治療，探討TTPGL 對糖尿病視網膜損傷的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級雄性SD 大鼠60 只，體質量200～240 g，購自錦州醫科大學實驗動物中心（動物編號：0000455），常規飼養，環境溫度20～25 ℃，濕度50%～70%。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，Sigma）；TTPGL 粉末（純度為98%，大連美倫公司）；HE 染色試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；兔源神經膠質酸性蛋白（GFAP）、核轉錄因子（NF）-κB、腫瘤壞死因子（TNF）-α抗體（英國Abcam公司）；免疫熒光染色試劑盒、Western blot 二抗（PTG 公司）。熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；冰凍切片機（德國SLEE 公司）；水平電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備 50 只大鼠按55 mg/kg 腹腔一次性注射STZ，72 h 后采尾靜脈血測血糖，將血糖＞16.7 mmol/L的大鼠定為糖尿病模型［8-9］，建模成功率為100%。模型誘導成功后，大鼠編號并按照隨機數字表法分成5組：糖尿病組（DM 組）、TTPGL 低劑量組（TTPGL-L 組，50 mg/kg）、TTPGL中劑量組（TTPGL-M組，100 mg/kg）、TTPGL高劑量組（TTPGL-H組，200 mg/kg）及二甲雙胍組（Met組，10 mg/kg，陽性對照），另取10 只正常大鼠作為對照（CON）組。動物成模1 周后，每天上午8:00—10:00 以2 mL 無菌生理鹽水溶解TTPGL后灌胃給藥，每日1次，灌胃劑量依據文獻［6-7］及預實驗。CON組及DM組給予2 mL生理鹽水，12周后進行各項指標檢測。整個實驗過程遵循國家《實驗動物管理條例》相關規定。

1.2.2 樣本制備 12周后，采集尾靜脈血檢測血糖水平。每組按隨機數字表法取5只大鼠，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3.5 mL/kg）。4%多聚甲醛灌注固定后取出眼球，石蠟包埋切片，厚度為5 μm，常溫保存，用于免疫熒光及HE 染色。每組另取5 只大鼠，以10%水合氯醛深度麻醉（7.0 mL/kg）處死后取視網膜，冰上剪碎裂解后靜置30 min，4 ℃、12 000 r/min離心25 min，留上清。BCA法測蛋白濃度并制樣，-20 ℃保存用于Western blot實驗。

1.2.3 免疫熒光染色檢測大鼠視網膜GFAP 表達 經1.2.2制備的切片脫蠟后浸于PBS洗滌3次，每次3 min；3%山羊血清+0.3%Triton-100室溫孵育1 h；不洗，滴加兔抗大鼠GFAP一抗（1∶300），4 ℃過夜；次日PBS 洗滌4 次，每次3 min；滴加熒光二抗，室溫避光1 h；PBS洗滌4次，每次3 min；封片后熒光顯微鏡觀察GFAP表達情況。

1.2.4 Western blot 檢測NF-κB、TNF-α 蛋白表達 取1.2.2制備的上清，每孔上樣50 μg 進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳后半干法轉膜（恒壓20 V，18 min），1%BSA 室溫封閉2 h。TBST 洗膜后NF-κB（1∶8 000）、TNF-α（1∶5 00）和內參β-actin（1∶20 000）一抗4 ℃雜交過夜。二抗室溫搖床孵育2 h。ECL 試劑盒顯色，Image J軟件分析目的蛋白和內參灰度值并計算相對表達量。

1.2.5 HE染色檢測RGC密度 經1.2.2制備的切片浸于PBS洗滌3次，每次3 min；滴加蘇木素染色2 min；PBS浸泡1 min，自來水沖洗；95%乙醇1 min，伊紅浸染2 min，自來水沖洗；脫水透明后封片，拍照后應用Image J 軟件計數RGC 數量并轉化成密度。

1.3 統計學方法 所有數據采用SPSS 20.0 統計軟件進行分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用SNK-q檢驗進行多重比較，方差不齊時采用Games-Howell 法，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠空腹血糖水平檢測結果 分組干預12 周后，與CON 組相比，DM 組血糖明顯升高（P＜0.05）；與DM組相比，TTPGL-M組、TTPGL-H組、Met組血糖依次降低（均P＜0.05），而DM組與TTPGL-L組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 各組大鼠視網膜GFAP表達水平比較 將CON組GFAP 蛋白熒光強度設定為100%，與CON 組相比，DM 組GFAP 熒光強度明顯升高（P＜0.05）；與DM 組相比，TTPGL-M 組、TTPGL-H 組、Met 組治療后GFAP 表達依次降低（均P＜0.05），DM 組與TTPGL-L 組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2、3。

Fig.1 Comparison of fasting blood glucose levels between six groups of rats圖1 6組大鼠空腹血糖水平比較

Fig.2 The expression of GFAP in retina between the six groups of rats(immunofluorescent staining,×400)圖2 6組大鼠視網膜GFAP的表達（免疫熒光染色，×400）

Fig.3 Comparison of GFAP expression in retina between six groups of rats圖3 6組大鼠視網膜GFAP表達水平比較

2.3 各組大鼠視網膜NF-κB、TNF-α蛋白表達水平比較 與CON組相比，DM組NF-κB、TNF-α表達明顯升高（P＜0.05）；與DM 組相比，TTPGL-M 組、TTPGL-H 組、Met 組NF-κB、TNF-α 表達依次降低（均P＜0.05），而DM組與TTPGL-L組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4、表1。

Fig.4 The relative expressions of NF-κB and TNF-α in retina between six groups圖4 6組大鼠視網膜NF-κB、TNF-α蛋白表達水平

2.4 各組大鼠視網膜RGC 密度比較 與CON 組相比，DM組RGC密度明顯下降（P＜0.05）；與DM組相比，TTPGL-M組、TTPGL-H組、Met組治療后RGC密度依次增加（均P＜0.05），而DM組與TTPGL-L組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見表1、圖5。

Fig.5 Comparison of retinal RGC density between six groups of rats(HE staining,×400，bar=25 μm)圖5 6組大鼠視網膜RGC密度比較（HE染色，×400，標尺=25 μm）

Tab.1 Comparison of relative expressions of NF-κB,TNF-α and RGC density of retina between six groups表1 6組大鼠視網膜NF-κB、TNF-α蛋白相對表達及RGC密度比較（n=5，±s）

Tab.1 Comparison of relative expressions of NF-κB,TNF-α and RGC density of retina between six groups表1 6組大鼠視網膜NF-κB、TNF-α蛋白相對表達及RGC密度比較（n=5，±s）

＊＊P＜0.01；a與CON 組比較，b與DM 組比較，c與TTPGL-L 組比較，d與TTPGL-M組比較，e與TTPGL-H組比較，P＜0.05

組別CON組DM組TTPGL-L組TTPGL-M組TTPGL-H組Met組F NF-κB蛋白相對表達量（%）4.16±0.23 22.43±1.76a 22.14±1.58a 12.04±1.02abc 10.17±0.97abcd 9.18±0.12abcde 438.194＊＊TNF-α蛋白相對表達量（%）6.24±0.35 24.17±1.53a 24.03±1.42a 8.58±0.12abc 6.34±0.09abcd 5.45±0.27abcde 552.128＊＊RGC密度（個/mm2）846.29±10.34 318.43±6.44a 322.09±6.17a 640.81±8.45abc 716.94±9.13abcd 835.72±10.86abcde 864.394＊＊

3 討論

糖尿病視網膜損傷長期以來被認為是一種血管疾病，但針對血管病變的治療并未取得滿意效果。目前研究證實，DM患者的視覺功能障礙與神經病變損傷關系密切［10］。RGC 是目前研究最多的視網膜損傷的靶點，DM 狀態下RGC 的丟失或損害是患者視力下降的重要原因［11-12］。本研究也證實，DM大鼠RGC密度明顯降低。因此，有效抑制RGC損傷是防治DM視網膜損傷的重要靶點。

有文獻報道TTPGL 可通過激活大鼠骨骼肌中的PI3K/AKT 信號傳導及調節氧化應激水平，對STZ誘導的DM 大鼠產生保護作用［13］；同時TTPGL 還具有抗炎作用［7］。本實驗采用低、中、高3 種劑量的TTPGL 對STZ 誘導的DM 大鼠進行灌胃治療，發現中、高劑量的TTPGL 可有效降低大鼠的血糖，且RGC密度也隨之增加，這說明TTPGL可能通過降低血糖保護受損的RGC。

GFAP為一種中間絲結構蛋白，在Müller細胞內的過度表達可損傷視網膜結構及功能［14］。本課題組前期研究發現，抑制DM狀態下GFAP的表達可增加RGC 密度，保護受損的神經元［15］。本研究發現，正常大鼠GFAP少量表達于視網膜GCL層，但在DM組GFAP 表達明顯上調，貫穿視網膜全層。中、高劑量的TTPGL 可明顯抑制GFAP 的表達，進而保護受損的RGC。Liu 等［14］研究發現，DM 時，不僅會引起視網膜GFAP 表達的增加，同時也會誘發視網膜炎癥反應，中藥柚皮苷可有效抑制GFAP的表達，進而抑制NF-κB炎癥通路，保護損傷的視網膜Müller細胞；而GFAP 也是炎癥反應活動的標志物［16］。因此，本研究進一步對炎性指標進行了檢測。

炎癥反應是機體消除損傷因子或修復組織損傷的免疫防御過程，其與DM 的關系尤為密切。越來越多的證據表明DM狀態下視網膜或玻璃體中多種神經炎性因子，包括NF-κB、TNF-α、白細胞介素（IL）-6等表達明顯增加［17］。NF-κB、TNF-α、IL-6等細胞因子表達上調可啟動炎性級聯反應，進一步激活核轉錄因子，最終誘導視網膜神經細胞凋亡。本研究發現，DM 組NF-κB、TNF-α 表達明顯上調，而中、高劑量的TTPGL 可明顯下調NF-κB、TNF-α 的表達，這與以往的研究相一致［18］，提示TTPGL 可能通過抑制炎癥反應進而增加RGC密度。

綜上所述，DM狀態下會引起RGC密度的降低，而應用TTPGL 治療后，可明顯增加RGC 密度，這可能與TTPGL降低血糖，下調視網膜GFAP的表達，抑制炎癥反應有關。當然，DM視網膜損傷發病機制復雜，TTPGL對其治療作用的相關機制仍需深入探討。