響應面法優化芽孢桿菌NBIN-863 的發酵工藝

劉曉艷，閔 勇，陳 偉，劉 芳，廖先清，周榮華，饒 犇

（湖北省生物農藥工程研究中心，武漢 430064）

中國土壤正在不斷惡化，土壤病蟲害發生種類日趨復雜，特別是作物的線蟲病害已成為常發性寄生蟲害，但市場上可供選擇的農藥品種卻很少，作物線蟲病的防治難度日益增加。芽孢桿菌是一類廣泛存在于土壤、湖泊、海洋、動植物表體的生防菌，多數菌株無致病性、生長速度快、營養需求簡單，在植物的表面易于存活、定殖、繁殖，對多種植物病害尤其是土傳病害有較好的防控效果；同時生產芽孢桿菌制劑的產業化生產工藝簡單，制劑穩定，儲存期長，施用方便，對人畜安全，對環境友好，是一種理想的防控線蟲的微生物菌劑［1-5］。

在前期的研究中分離得到蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）NBIN-863 菌株，研究表明其能顯著抑制線蟲生長，具有一定的開發價值。通過對該菌株進行發酵培養基的優化［6-8］，可以提升該菌株的發酵水平，加快其產業化進程。本研究對NBIN-863的培養基配方進行Plackett-Burman 試驗，篩選顯著的影響因子，通過中心組合設計和響應面分析，獲得最優培養基組合，以期為該菌株的擴大生產及產業化提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

蘇云金芽孢桿菌NBIN-863 由湖北省生物農藥工程研究中心分離和保藏。

1.2 供試培養基

①種子培養基。LB 液體培養基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，500 mL 三角瓶裝液量為100 mL；②初始發酵培養基：淀粉10 g，豆粕20 g，磷酸二氫鉀0.1 g，去離子水1 L，pH 7.5，500 mL 三角瓶裝液量為50 mL。

1.3 搖瓶培養

斜面菌種活化后接入LB 液體培養基，30 ℃、搖床轉速220 r/min 條件下培養16 h，按2%（V/V）接種量再接入到發酵培養基中至芽孢脫落分離20%。

1.4 芽孢數的測定

培養結束后發酵液芽孢數采用稀釋涂布平板計數法測定。1.5 方法1.5.1 Plackett-Burman（PB）設計 采用Minitab 的Plackett-Burman 兩水平法對培養基成分進行分析，篩選影響生物量和芽孢產量的主要因素，確定最佳配方。

1.5.2 最陡爬坡試驗 根據PB 試驗得出的擬合方程，安排最陡爬坡試驗來確定因素，取值中心點。擬合方程中各變量系數確定爬坡方向和變化步長，此外，步長確定與試驗條件相關。

1.5.3 中心組合設計和響應面分析 根據PB 試驗得到的因素，以最陡爬坡試驗得到中心點，根據中心組合設計原理設計響應面試驗的最佳配方水平。得到描述響應值和自變量之間關系的二階模型，即：

式中，Y 是產物能力測量值；b0是截距；bi是關鍵因素線性效果的系數；bii是關鍵因素二次效應的系數；bij是關鍵因素間交互作用的系數；e 是修正系數。

根據擬合的模型以及方差分析的結果，可以評價每個因子及其交互作用對過程的影響程度，利用響應面和等高線直觀地描繪其結果，同時利用擬合方程求解最優的結果。

1.5.4 培養基優化結果的驗證試驗 用優化后的培養基組分配制發酵培養基，發酵結束后測定發酵液的芽孢數。

1.5.5 20 L 罐發酵 用優化后的培養基組分配制發酵培養基，投料體積10 L，消泡劑0.2%，滅菌前pH 7.5，1×105Pa 滅菌30 min。待溫度降至32 ℃時接入1%（V/V）的種子液，通氣比1∶0.5～1.2，罐壓0.5×105Pa，培養溫度30～32 ℃，攪拌常開，發酵過程中取樣鏡檢，芽孢脫落分離20% 時結束發酵。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗設計

根據前期單因素試驗研究結果，確定以淀粉為碳源，以豆粕、酵母膏、工業蛋白胨為氮源，共4 種因素：X1（淀粉）、X2（豆粕）、X3（酵母浸粉）、X4（工業蛋白胨）一起進行Plackett-Burman 設計試驗，發酵結束時稀釋20 倍測定死亡率，設計方案和試驗結果見表1。

由表2 可知，淀粉和豆粕對NBIN-863 的效價有顯著影響，且兩者對芽孢形成的影響均是正效應。

表1 Plackett-Burman 試驗設計與結果

表2 Plackett-Burman 試驗各因素參數的t檢驗分析結果

得到的回歸方程如下：

方程擬合的相關性為R2=0.905 7，表明此多項式方程很好地模擬和解釋了Plackett-Burman 的試驗結果。

2.2 最陡爬坡試驗

找到對產物發酵影響最大的因素，對這些因素進行進一步分析。最常用的分析方法就是響應面分析，但響應面分析是一種局部的分析方法，是在一定范圍內根據試驗求得最優解。因此，在進行響應面分析試驗前，首先應當通過試驗找到最優值附近的區域，在此區域內再進行響應面試驗。

利用最陡上升法試驗，以前述Plackett-Burman設計試驗得到的一次方程為基礎，以相應因素的系數比為基準進行步移，直到步移至最高點，然后以最高點附近的范圍作為響應面優化的相應范圍。從Plackett-Burman 設計試驗得到方程中淀粉和豆粕的系數（X1為9.000，X3為9.333），進而可以得這2個因素步移的步長比為0.96∶1，即當豆粕步移1 個單位（5 g/L）時，淀粉步移0.96 個單位（4.8 g/L）。以Plackett-Burman 設計中的中心點（淀粉為25 g/L；豆粕為25 g/L）作為步移的起點，試驗設計與試驗結果見表3。從表3 可以看出，開始時NBIN-863 對線蟲的致死率隨著淀粉與豆粕的升高而增加，在步移進行至第二步時達最高點，之后NBIN-863 發酵液的致死效果開始下降。步移最高點時淀粉與豆粕的濃度分別為34.6 g/L 和35 g/L，這一點被用作下一步響應面分析的中心點。

表3 最陡爬坡試驗設計與結果

2.3 中心組合設計試驗及響應面分析

由以上2 水平Plackett-Burman 試驗可知，影響NBIN-863 致死率的2 個重要因素分別是淀粉與豆粕。根據中心優化組合方法，設計了2 因素5 水平的響應面分析（RSA），試驗設計見表4，共13 組試驗。

以淀粉和豆粕為自變量，以NBIN-863 對線蟲的致死率為響應值，根據分析結果得到的二次多項式回歸方程為：

式中，Y 為響應值，X1為淀粉，X2為豆粕。

利用Minitab 軟件對回歸模型進行響應面分析，考察所擬合響應面的形狀，結果見圖1 和圖2。由圖1、圖2 及軟件分析可知，該模型具有最大值，利用Minitab 軟件響應優化器進行計算可得，最大值處X1= 35.2 g/L，X2=34.7 g/L，在此條件下理論預測得到線蟲致死率為81.2%。

表4 中心優化組合設計與結果

圖1 NBIN-863 發酵液對線蟲致死率的等值線

圖2 NBIN-863 發酵液對線蟲致死率的曲面分析

2.5 最佳培養基的驗證

為了確定試驗結果的可靠性，對上述優化培養基進行了驗證試驗，共進行3 組平行試驗，測得NBIN-863 發酵液對線蟲的致死率為83.0%，與預測值（81.2%）十分接近，比優化前NBIN-863 的實際致死率（45.0%）提高了84%。

2.6 20 L 罐發酵

發酵周期36 h，放罐時取樣鏡檢，約20% 芽孢脫落，伴孢晶體全部形成，晶體含量為5.4 mg/mL，芽孢整齊。發酵液經稀釋后，其對線蟲的致死率是81.0%，較好地保持了揺瓶發酵時的活性。

3 討論

前期研究表明，影響NBIN-863 菌株活性的關鍵因素為淀粉與豆粕。通過優化獲得NBIN-863 菌株最佳培養基配方為淀粉35.2 g/L、豆粕34.7 g/L、酵母浸粉4 g/L、工業蛋白胨3 g/L。在此條件下，測得NBIN-863 發酵液的晶體含量為5.4 mg/mL，稀釋后對線蟲的致死率為81.0%，比優化前NBIN-863的實際致死率提高了80%，為其工業化生產奠定了基礎。