黃連木性別鑒定研究進展

陳嘉裔

（東南大學成賢學院，江蘇南京 210088）

黃連木屬（Pistacia）屬漆樹科（Anacardiaceae）植物，雌雄異株，全世界約10種，分布于地中海沿岸、阿富汗，亞州中部、東部和東南部，菲律賓至中美墨西哥和南美危地馬拉［1］。我國有3種，除東北和內蒙古外均有分布［2-3］。本屬植物均具有較高的經濟用途，如中國黃連木（Pistacia chinensis）作為生物燃料油樹種，是一種極其重要的木本能源植物［4］；阿月渾子（Pistacia vera）兼具木本油料和干果兩大功能，干果商品名為開心果，是世界四大堅果之一［5］；清香木（Pistacia weinmannifolia）除葉可提取芳香油外，葉及樹皮還可作藥用［3］。

黃連木屬雌雄株的早期性別鑒定在科研與實踐方面都具有重大意義。首先，不同性別的植株往往具有不同的經濟價值，如中國黃連木雌株因其種子可作為生物柴油的原料而具有相較雄株更高的經濟價值，雄株則是不可或缺的授粉樹［6-7］，兩者種植比例需要合理規劃；其次，黃連木童期一般需6～10年，時間漫長，期間若不采取方法對黃連木雌雄株性別進行準確鑒定，將為黃連木育種改良工作帶來巨大障礙［8］。因此黃連木性別鑒定研究在其生產以及遺傳育種研究方面都顯得尤為重要。

近年來，研究發現黃連木屬在自然狀態下并不僅僅只有雌株、雄株2個性別表現型，如中國黃連木存在雌雄同花序、大西洋黃連木（Pistacia atlantica）不同側枝性別各不相同等［9-10］，這些現象給黃連木性別鑒定工作帶來更多困難。但雌雄個體間的差異總還是會在某些宏觀或微觀上表現出來，特別是隨著近年來分子生物學等新學科新技術的不斷發展，更多植物性別鑒定的原理與方法也隨之產生，為傳統植物的性別鑒定研究工作帶來重大變革［11］。

1 黃連木性別鑒定研究進展

1.1 基于形態差異關于雌雄異株植物性別鑒定的研究早期都是從形態學入手，因為雌雄異株植物基因水平不同，植株形態也會存在或多或少的差異，由此可對植株性別進行鑒定。例如，在對植株外部形態的研究中，馬麗媛等［13］研究發現，中國黃連木雄株葉片的葉形指數顯著小于雌株，雄株的葉形偏狹長，雌株的葉形偏短寬；雄株的葉面積極顯著小于雌株；黃連木雌株的主枝分枝角度極顯著大于雄株，外觀表現為雄株樹冠抱攏，雌株樹冠開張。譚冬梅等［14］對阿月渾子進行了形態學觀測，發現雌雄株的葉形指數也存在極顯著差異，結論與中國黃連木研究結果基本一致。而在對植株葉片的微觀研究中，王小燕［15］研究發現，10年生中國黃連木雌雄株葉片間氣孔密度、氣孔長度與寬度并無顯著差異，僅在40年生植株中存在極顯著性差異，這說明植物形態特征不僅與基因水平上的差異有關，還可能受發育階段、外界環境等多方面的影響，因此基于外部形態差異的鑒定雖然簡單直接，但并非黃連木性別鑒定的可靠依據，只能作為鑒定體系中的一部分。

1.2 基于生理生化差異在生理生化方面，雌雄株的差異主要體現在代謝過程中某些酶的活性差異以及其內源激素、氨基酸、次生代謝物質的含量不同等［16］。楊鷺生等［12］用溴麝香草酚蘭（BTB）方法，成功對中國黃連木雌雄株進行性別鑒定。馬麗媛等［13］通過測定中國黃連木雌雄株多胺含量以及內源激素的差異來對黃連木進行鑒定，結果表明：中國黃連木雄株葉片在各生長時期Spm（精胺）含量高于雌株、Put（腐胺）含量低于雌株，ABA、IAA含量均大于雌株。然而，Said等［17］通過熒光速率測量，結果表明：乳香黃連木（Pistacia lentiscus）量子產量和色素含量受季節影響，雌雄Fv∕Fm比值在春天顯著高于雄株，而夏天雄株高于雌株。王小燕［15］對10年、40年樹齡不同生長時期的中國黃連木雌雄株生理指標進行測定，結果顯示：2種樹齡的中國黃連木雌雄株葉片的可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛含量，10年生雌雄株間差異達到顯著水平，40年生則無明顯差異。由此可見，基于生理生化的性別鑒定也并非完全可靠，環境因素以及植物自身發育狀況等都會對鑒定結果產生干擾。

1.3 基于同工酶圖譜植物的性別主要受基因調控，而同工酶是分子水平的指標，是基因差異在表達水平的體現，具有組織、發育及物種的特異性，是植物性別鑒定的有效途徑之一［18］。目前，對同工酶的研究主要有酯酶（EST）、過氧化物酶（POD）以及多酚氧化酶（PPO），其中大多數集中在對雌雄器官中POD的研究。程世平［19］發現中國黃連木雌雄株在過氧化物酶（POD）、酯酶（EST）和多酚氧化酶（PPO）3種同工酶的酶譜上都存在明顯差異。李國平等［20］通過對中國黃連木雌雄株發育不同階段的葉片中PPO和POD相對活性進行比較，發現PPO、POD相對活性在雌雄株間存在顯著差異，在老葉中則存在極顯著差異。以雌雄個體間存在的顯著特征譜帶差異來對黃連木進行雌雄鑒別，方法較簡單，可用于實驗室黃連木的研究，但這一技術依然受限于同工酶組織特異性、發育階段以及生境等方面的影響，還需進一步完善其可靠性［21］。

1.4 基于特異蛋白差異近年來，蛋白質組學的研究不斷深入，這對于雌雄異株植物的性別鑒定工作具有很大幫助［22-24］。Xiong等［25］利用蛋白質組學中的雙向電泳技術對中國黃連木雌雄株的葉片和莖段進行研究，共發現10個差異蛋白質點，成功鑒定出其中7個；研究還發現，性別相關的蛋白質具有不同的組織特異性，在枝條中這種差異更為明顯：如溫度誘導的脂質運載蛋白在雄株枝條的木質部和韌皮部顯著表達遠高于雌株，而雄株枝條的韌皮部中沒有表達磷酸甘油酸激酶蛋白，在雌株卻高豐度表達。這些研究結果不僅表明通過蛋白質組學相關技術可有效對黃連木進行性別鑒定，同時也為進一步研究黃連木性別差異的生化機制提供了可能。

1.5 基于分子標記DNA分子間的差異及基因的表達差異是導致植物性別差異的主要原因，目前在黃連木的性別鑒定中，已用到的DNA分子標記技術主要有RAPD、SCAR和SNP。

1.5.1 基于隨機引物PCR的RAPD分子標記技術 隨機擴增多態性DNA（RAPD）［26，27］是以一寡聚核苷酸序列（4～20bp）為引物，對所研究的基因組DNA進行隨機PCR擴增，產生擴增片段長度多態的分子標記技術，具有相對易操作、省時省力、多態性好等特點，受到廣泛關注［28］。Hormaza等［29］利用700對RAPD隨機引物對阿月渾子進行研究，結果顯示引物（opo08945）在945pb處發現雄株有特異帶，這一標記的發現對阿月渾子性別鑒定具有重要意義。KAFKAS等［30］對大西洋黃連木472對隨機多態引物RAPD，篩選出2對和大西洋黃連木性別相關的標記引物BC156和BC360，其中BC360（500bp）可能與雌性性別決定位點相關。由此可見，RAPD技術的特異引物對黃連木屬其他植物的性別鑒定是無效的，且RAPD仍然存在著一些不足：如要經歷繁瑣的引物篩選過程、對試驗條件較敏感、試驗重復性差等，目前僅在引物初篩過程中具有一定的應用價值。

1.5.2 基于序列特征化擴增區域的SCAR分子標記技術SCAR分子標記是以PCR為基礎，利用RAPD、AFLP等技術找到與目的性狀相連鎖的標記后發展而來的，在原來10個堿基的引物基礎上增加合成上述末端序列約14個堿基構成，具有已知序列、標記共顯性、簡單易用、重復性好等優點，在植物分子育種中應用廣泛［31，32］。Yakubov 等［33］將RAPD轉化為SCAR標記來鑒定阿月渾子，發現在909pb和905pb片段，雌雄株分別具有較高的同源性（95%）；基于此片段設計了新的SCAR引物多態位點，在297bp片段處能很好地區分雌雄。Esfandiyari等［34］將DNA 的RAPD 標記基因導入SCAR 區以大規模篩選野生黃連木雌雄種，開發了與黃連木性別相關的1 個300bp 的SCAR 標記（BC1200），該標記只存在于研究的所有雌性個體，而不存在于雄性個體。Sun等［35］也通過ISSR技術找到2個與中國黃連木雌株基因位點相連鎖的標記S1和S281，并成功開發出一個為636pb的SCAR標記（FS281）片段。程世平［19］通過對200條RAPD隨機引物的篩選，篩選出可在雌雄株基因池間擴增出差異條帶的6條引物，并成功開發了與雌株相關的550bp的SCAR引物S1420-11C，可對中國黃連木的性別進行準確鑒定。這些研究結果表明SCAR標記對黃連木屬的植株標記并不通用，Kafkas等［36］對大量阿月渾子和野生黃連木種質資源進行測試，結果也表明有遺漏的雌株和誤報的雄株個體。

1.5.3 基于DNA芯片技術的SNP分子標記技術 單核苷酸多態性（SNP）是指同一位點的不同等位基因之間只有1個核苷酸的差異或只有小的插入、缺失。SNP是一種多態性較高的雙等位型標記，是一種應用前景廣闊的遺傳標記物［37］。Kafkas等［36］以阿月渾子9個雌株和9個雄株為材料，利用Hi-Seq2000進行測序（Illumina），通過RAD開發出33757個SNP標記，確定了38對候選連鎖標記，通過檢測并設計SNP引物，其中8對能準確區分阿月渾子性別后代，并在大量黃連木屬植物中得以驗證。SNP技術具有基因定位功能，能準確區分顯性和共顯性基因位點，使得追溯基因源成為可能。同時，基于SNP 的高度多態性也為黃連木屬其他植株的鑒定提供一種新的手段。

2 結語

綜上所述，基于外部形態、生理生化的2種方法相對簡單易行，都為黃連木性別鑒定研究提供了事實依據，但不夠準確，容易受環境影響，利用價值不高；利用同工酶、特異蛋白、分子標記等技術的鑒別結果雖然相對可靠，但這些鑒定技術所需儀器和環境要求普遍較高，同時存在操作繁瑣、鑒定價格昂貴等問題，在實際生產中也難以推廣運用。植物性別決定機制主要由遺傳因子和環境因素決定，隨著分子生物學技術的日益發展，綜合利用各種性別鑒定技術，逐步了解控制黃連木性別遺傳的機理，黃連木早期性別鑒定難題將會得到解決。