野生白銀盤的鑒定及其生物學特性研究初報

許 晶，劉 虹，車星星，李素玲

（山西農業大學山西功能食品研究院，山西太原030031）

白銀盤是山西管涔山地區一種著名的白色野生食用菌，因其盛產在入伏期即每年7月下旬到8月上旬，被當地人稱為白銀盤或伏銀盤[1]。該蘑菇肉質肥厚、味道鮮美、口感軟滑[2-3]，因此，深受當地村民歡迎。白銀盤不僅可以食用，還具有多種藥用價值[4-8]。其子實體可治小兒麻疹、傷風感冒、煩燥不安，因其能產生杯傘素（Clitocy bin）而具有抗肺結核病以及促進宮頸癌細胞凋亡的作用[9]；深層發酵生產的菌絲體及濾液中含有抗腫瘤活性成分，能夠增強人體免疫功能，在國際上被稱為生物反應調節劑（Biolog ical response modifier，BRM）[10]。

目前，白銀盤市場價格在40～60元/kg不等，成為當地村民主要的經濟來源之一。白銀盤的自然采集量已呈明顯下降趨勢，難以滿足市場需求。因此，開展野生白銀盤的馴化工作勢在必行[6]。目前，野生白銀盤人工馴化栽培的報道極少，對其的鑒定也主要以形態特征鑒別為主。

本研究利用從山西管涔山采集的野生白銀盤，在形態特征鑒定的基礎上對其進行了分子鑒定，并對菌絲體進行了生物學特性研究，以期為白銀盤的人工馴化栽培奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試樣本（LH170701） 野生白銀盤子實體2017年采自山西管涔山地區海拔1 800 m的云杉和落葉松混交林草地上，新鮮且無病蟲害。對樣本采用組織分離法獲得菌株材料，并經純化后篩選生長旺盛的菌株作為研究材料。

PCR引物由上海生工生物技術有限公司合成。

1.1.2 母種培養基 馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂粉20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，水1 000 mL。

1.1.3 平板培養基 葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂粉20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B10.03 g，硫酸鐵0.1 g，水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 形態學鑒定 在手持放大鏡和體視顯微鏡下進行子實體宏觀特征觀察，主要觀察子實體的形狀、顏色、大小、菌蓋、菌柄及菌褶等。子實體的顯微結構觀察在光學顯微鏡下進行，用蒸餾水和3%KOH制作水封片，用棉蘭和Melzer試劑檢驗擔孢子壁是否喜蘭以及淀粉質的反應。

1.2.2 分子鑒定 在北京首都師范大學生命科學學院微生物實驗室采用CTAB法提取樣本的DNA，PCR擴增在FTGRAD2D型PCR擴增儀上進行，ITS測序工作由北京中科希林生物技術有限責任公司完成。測序后ITS基因序列通過BLAST程序與GenBank數據庫中所收錄的ITS基因序列進行同源性比對，結合形態學特征對樣本進行鑒定。

1.2.3 碳源試驗 以平板培養基作為對照，分別以相當碳量的果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和淀粉代替其中的葡萄糖，設6個處理，每個處理3次重復，每個重復5個平板。

1.2.4 氮源試驗 以平板培養基作為對照，分別以相當氮量的牛肉膏、酵母膏、麥麩、硫酸銨和尿素代替其中的蛋白胨，設6個處理，每個處理3次重復，每個重復5個平板。

1.2.5 碳氮比試驗 以平板培養基中的葡萄糖作為碳源，蛋白胨作為氮源，碳氮總量23 g，按照1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1的碳氮比分別設置7個處理，每個處理3次重復，每個重復5個平板。

1.2.6 溫度試驗 在平板培養基中，設15、18、21、25、28、31℃共6個培養溫度處理，每個處理3次重復，每個重復5個平板。

1.2.7 pH試驗 用1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉對平板培養基進行酸堿度調整，共設4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0等7個pH值，每個處理3次重復，每個重復5個平板。

碳源、氮源、碳氮比和pH值試驗的平板均在25℃恒溫下暗光培養7 d，溫度試驗在不同的溫度下暗光培養7 d，每3 d進行一次觀察和測量，計算菌絲的日生長速度。

1.3 數據分析

相關數據采用Excel 2003、SPSS 9.0、LSD法進行數據處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 形態學特征

擔子果中到大型，菌蓋生長初期呈扁半球形，后逐漸平展，中部下凹，后期直徑可達6～20 cm，表面光滑，無絨毛，邊緣整齊，無條紋，白色，有時中部呈淺黃白色；菌肉白色，厚實；菌褶白色，不等長，較密，直生或稍延生；菌柄圓柱狀，長5～8 cm，直徑2～4 cm，白色，表面平滑，中實；擔孢子橢圓形，（5.5～7.5）μm×（4～5）μm，無色，表面光滑，弱淀粉質。

2.2 ITS-DNA測試比對結果

提取的ITS-DNA片段在NCBI上用BLAST比對結果顯示（表1），樣本（LH170701）與數據庫中的10個序列屬于同源序列，相似度都在97%以上，與來自美國序列KP453713的ITS相似度最高，為99%，結合形態學可以確定本研究采自中國山西管涔山地區的白銀盤是大白樁菇，學名是Aspropaxillus septentrionalis（Singer&Smith）Vizzini。

表1 白銀盤樣本的ITS片段在NCBI上BLAST結果

2.3 不同碳源對白銀盤菌絲生長的影響

碳源是食藥用菌生長所必需的營養物質。由表2可知，不同碳源培養基上，白銀盤菌絲生長勢和生長速度呈極顯著差異。在以葡萄糖為碳源的培養基上，菌落呈圓形而完整，菌絲潔白、粗壯、濃密、生長勢強，日生長速度最快，為3.58 mm/d，顯著高于其他的碳源；蔗糖和麥芽糖表現次之；果糖表現最差，菌絲乳白色、稀疏，生長勢極弱，日生長速度最慢，為2.55 mm/d。

表2 不同碳源對白銀盤菌絲生長的影響

2.4 不同氮源對白銀盤菌絲生長的影響

氮源是食藥用菌生長的第二大營養液。由表3可知，不同氮源菌絲的生長情況有著顯著差異。在以牛肉膏和酵母膏為氮源的培養基上，白銀盤的菌落圓形、完整，菌絲潔白、粗壯、濃密、生長勢強，日生長速度快，分別為3.58、3.31 mm/d，與其他氮源的差異達顯著水平；麥麩和硫酸銨表現次之；尿素表現最差，菌絲僅在接種塊周圍生長甚至不生長。

表3 不同氮源對白銀盤菌絲生長的影響

2.5 不同碳氮比對白銀盤菌絲生長的影響

從表4可以看出，白銀盤菌絲在碳氮比為（1∶1）～（30∶1）的培養基上均可生長，但生長速度存在顯著差異。在10∶1的培養基上生長勢最強，日生長速度最快，為3.67 mm/d，與其他碳氮比菌絲生長呈顯著差異；其次為5∶1和15∶1，二者差異不顯著，但與其他碳氮比菌絲生長呈顯著差異；表現最差的為1∶1和30∶1，菌絲稀疏、生長勢弱、生長速度最慢。

表4 不同碳氮比對白銀盤菌絲生長的影響

2.6 不同溫度對白銀盤菌絲生長的影響

從表5可以看出，白銀盤的菌絲在15～31℃下均可生長，但生長勢、日生長速度存在極大差異。菌絲最適宜的培養溫度為21～25℃，菌落濃密、菌絲粗壯、生長勢最強、日生長速度最快，分別為3.57、3.54 mm/d，與其他溫度下菌絲生長差異顯著；當溫度低于21℃時，菌絲日生長速度隨溫度的升高逐漸加快，且生長勢趨好；當溫度高于25℃時，菌絲生長速度隨溫度的升高逐漸減慢，且生長勢減弱。

表5 不同溫度對白銀盤菌絲生長的影響

2.7 不同pH值對白銀盤菌絲生長的影響

從表6可以看出，白銀盤在pH值5.0～8.0的范圍內均可生長，但隨著pH值的升高，菌絲日生長速度呈現先升后降的趨勢，但以pH值7.0和pH值7.5表現最好，即菌絲生長勢最強、日生長速度最快，分別為3.62、3.70 mm/d，與其他pH值的菌絲生長差異達顯著水平；pH值低于5.0或高于7.5時，菌絲日生長速度顯著減慢；pH值4.0時菌絲不生長。

表6 不同pH值對白銀盤菌絲生長的影響

3 結論與討論

通過形態學和ITS-DNA序列鑒定，確定了在山西管涔山地區采集的野生白銀盤是隸屬傘菌目白蘑科樁菇屬的大白樁菇（Aspropaxillus septentrionalis）。

通過生物學特性研究可以看出，白銀盤菌絲生長的最適宜碳源是葡萄糖，其次是蔗糖和麥芽糖；適宜菌絲生長的最佳碳氮比為10∶1，其次為5∶1和15∶1；最適宜的pH值為7.0～7.5；適宜菌絲生長的溫度為21～25℃。

在氮源培養基中，牛肉膏、酵母膏、麥麩和硫酸銨對菌絲的生長都優于蛋白胨，最適宜的氮源是牛肉膏和酵母膏，其次是硫酸銨；說明有機氮源和無機氮源對白銀盤菌絲生長都有不同程度的促進作用。