外源水楊酸對(duì)葡萄葉片黃烷-3-醇積累的影響

楊 波，衛(wèi) 穎，梁長(zhǎng)梅，張鵬飛，牛鐵泉，樊瑋鑫，溫鵬飛

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，山西太谷030801）

葡萄葉片是一種來(lái)源于自然，安全無(wú)害的傳統(tǒng)中藥材，具有安胎、消腫、利尿作用，并且含有豐富的維生素和礦物質(zhì)[1]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可用于新鮮食品（如土耳其、希臘等的菜肴[2]）的制備，也可從中提取藥物添加劑[3]，因其蛋白含量豐富，亦可作為飼料添加劑，改善禽魚(yú)肉蛋等產(chǎn)品質(zhì)量、降低飼料消耗率。葡萄葉片中含有大量多酚類化合物，如黃酮醇、黃酮[4]、酚酸和黃烷-3-醇[5]（如兒茶素、表兒茶素、表?xiàng)攦翰杷氐龋┮约吧倭慷揭蚁ㄈ绨邹继J醇、反式白藜蘆醇等）類物質(zhì)[6]，具有潛在開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值。其中，黃烷-3-醇不僅參與植物本身的生長(zhǎng)發(fā)育[7]，賦于植物抗紫外線、抗蟲(chóng)害、抗傷害、抗離子毒害等功能[8]，對(duì)人類健康也具有重要作用，由于其具有極強(qiáng)的抗氧化功能[9]，在抗菌、抗病毒、抗癌、抗血栓、抗腫瘤、降血壓、降低心臟代謝風(fēng)險(xiǎn)[10]等方面具有重要作用。葡萄日常管理中，為了保證果實(shí)的質(zhì)量，會(huì)多次除去植株外周葉片，作為廢棄物丟棄。此外，葡萄植株每年自然脫落的葉片，多被焚燒，不但造成天然酚類物質(zhì)資源的浪費(fèi)，還污染環(huán)境，造成了一定的資源損耗和經(jīng)濟(jì)浪費(fèi)。因而，對(duì)廢棄葡萄葉片的酚類物質(zhì)富集研究可以有效利用生態(tài)資源。

葡萄葉片中多酚類物質(zhì)的合成和積累不僅受到結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因的調(diào)控，還受到外界條件（如光照、水分、外源激素）的影響。其中，水楊酸（Salicylic acid，SA）作為一種植物調(diào)節(jié)劑[11]，不僅能夠促進(jìn)植物（如大麥[12]、當(dāng)歸[13]）幼苗生長(zhǎng)，而且能夠促進(jìn)植物細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)和次生代謝物積累，誘導(dǎo)一系列與抗逆有關(guān)的基因表達(dá)，提高植物的抗鹽性[14]、耐熱性[15]和抗寒性。KUMARI等[16]研究證實(shí)，水楊酸和殼聚糖的聯(lián)合處理，保持了荔枝果實(shí)中較高的花青素、總酚、類黃酮含量[17]。GHASEMZADEH等[18]研究發(fā)現(xiàn)，外源SA可以誘導(dǎo)生姜花色苷的合成。GIMéNEZ等[19]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol/L SA可顯著提高采收期甜櫻桃果實(shí)總酚酸含量。許玉超[20]研究表明，外源SA可顯著增加白菜葉片的總酚含量。IDREES等[21]、KHAN等[22]觀察到葉面噴施0.5 mmol/L SA可顯著提高水稻幼苗、紫花苜蓿幼苗的花青素含量。因而，外源SA對(duì)植物多酚物質(zhì)，特別是總酚、花青素具有一定調(diào)控作用，但是對(duì)黃烷醇類多酚，特別是對(duì)黃烷-3-醇的積累研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用外源水楊酸（SA）孵育葡萄新梢的方法，初步探究了SA對(duì)葡萄葉片黃烷-3-醇積累的作用，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試早黑寶葡萄采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站溫室，株行距2.5 m×1.0 m，籬架栽植，常規(guī)管理。

1.2 試劑

兒茶素、表?xiàng)攦翰杷亍⒈韮翰杷亍⒈韮翰杷貨](méi)食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚均購(gòu)自索萊寶公司；乙腈、冰乙酸、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、甲醇等試劑均購(gòu)自國(guó)內(nèi)國(guó)藥公司。

1.3 試驗(yàn)方法

選取30株健康且長(zhǎng)勢(shì)基本一致的早黑寶葡萄，采集新梢（帶葉柄7～10 cm），將葉柄插入錐形瓶中，以0.5 mmol/L SA孵育為處理，以蒸餾水孵育為對(duì)照（SA及蒸餾水液面高度保持在錐形瓶高度的4/5處），每個(gè)錐形瓶中插8個(gè)，5個(gè)錐形瓶為一組，9：00放于ED型光照培養(yǎng)箱（光照強(qiáng)度2 000 lx、相對(duì)濕度70%、溫度25℃）中培養(yǎng)，分別于0、1、3、6、12、24、72、120、192、240 h取葉片于液氮中凍存待用。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

總酚、總類黃酮測(cè)定參照陳建業(yè)[23]方法，稍作修改。總黃烷-3-醇測(cè)定參照楊麗等[24]方法，稍作修改。黃烷-3-醇單體測(cè)定利用高效液相色譜法。

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 分別精確稱取黃烷-3-醇中的標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素、表?xiàng)攦翰杷亍⒈韮翰杷亍⒈韮翰杷貨](méi)食子酸酯，用甲醇配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液，再稀釋成不同濃度的工作液，-20℃保存。

1.4.2 色譜條件Themo Fisher UltiMate3000色譜儀，Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，280μm），Dionex Ultimate 300 Diode Array Detector檢測(cè)器，流動(dòng)相B為1.3%冰乙酸，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為5μL。

1.4.3 樣品前處理 參照溫鵬飛[8]方法，略有修改。葡萄葉片于液氮下迅速研磨至粉末狀，準(zhǔn)確稱取0.3 g于10 mL離心管中，加入3 mL 70%甲醇，上下?lián)u勻10次，超聲波提取15 min；10 000 r/min離心10 min后取上清液2.5 mL，12 000 r/min離心10 min，取上清液，過(guò)夜浸提，經(jīng)0.45μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)8 min后加入1 mL純凈水提取，加入2 mL乙酸乙酯，搖勻靜置后取上層液體，恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)5 min后用1 mL純甲醇提取，經(jīng)0.22μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后，高效液相色譜儀測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SAS 8.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA孵育對(duì)早黑寶葡萄葉片總酚含量的影響

在0～6 h內(nèi)，相比對(duì)照，總酚含量隨SA孵育時(shí)間的加長(zhǎng)而增加，在1 h時(shí)出現(xiàn)最高峰，總酚含量在1、3 h時(shí)極顯著高于對(duì)照，192 h時(shí)顯著低于對(duì)照，240 h時(shí)極顯著低于對(duì)照，其他孵育時(shí)間與對(duì)照間無(wú)顯著性差異（圖1）。

2.2 SA孵育對(duì)早黑寶葡萄葉片總類黃酮含量的影響

在0～6 h內(nèi)，相比對(duì)照，總類黃酮含量隨SA孵育時(shí)間的加長(zhǎng)而增加，總類黃酮含量在1 h時(shí)出現(xiàn)最高峰，總類黃酮含量在1、3 h時(shí)顯著高于對(duì)照，12、72、240 h時(shí)顯著低于對(duì)照，192 h時(shí)極顯著低于對(duì)照，其他孵育時(shí)間與對(duì)照間無(wú)顯著性差異（圖2）。

2.3 SA孵育對(duì)早黑寶葡萄葉片總黃烷-3-醇含量的影響

在0～3 h內(nèi)，相比對(duì)照，總黃烷-3-醇含量在SA孵育3 h時(shí)出現(xiàn)高峰。總黃烷-3-醇含量在1、3 h時(shí)極顯著高于對(duì)照，72、240 h時(shí)顯著低于對(duì)照，192 h時(shí)極顯著低于對(duì)照，其他孵育時(shí)間與對(duì)照間無(wú)顯著性差異（圖3）。

2.4 SA孵育對(duì)早黑寶葡萄葉片兒茶素含量的影響

SA孵育葡萄新梢，兒茶素含量在1 h達(dá)到最高峰，兒茶素含量在1、120 h時(shí)極顯著高于對(duì)照，較對(duì)照分別提高了1.55、1.75倍，24 h時(shí)顯著高于對(duì)照，其他孵育時(shí)間與對(duì)照間無(wú)顯著性差異（圖4）。

2.5 SA孵育對(duì)早黑寶葡萄葉片表?xiàng)攦翰杷睾康挠绊?/h3>

SA孵育葡萄新梢，表?xiàng)攦翰杷睾吭?4 h出現(xiàn)最高峰，表?xiàng)攦翰杷睾吭?、6、24、72、120、240 h時(shí)均極顯著高于對(duì)照，較對(duì)照分別提高了7.15、10.03、1.50、7.59、12.78、6.43倍，1 h時(shí)顯著高于對(duì)照，其他孵育時(shí)間與對(duì)照間無(wú)顯著性差異（圖5）。

2.6 SA孵育對(duì)早黑寶葡萄葉片表兒茶素含量的影響

SA孵育葡萄新梢，表兒茶素含量在12 h出現(xiàn)最高峰，表兒茶素含量在12 h時(shí)極顯著高于對(duì)照，較對(duì)照提高5.16倍，6、24、72 h時(shí)顯著高于對(duì)照，其他孵育時(shí)間與對(duì)照間無(wú)顯著性差異（圖6）。

3 討論

本研究結(jié)果表明，早黑寶葡萄新梢葉片在離體條件下經(jīng)0.5 mmol/L SA孵育，在0～6 h內(nèi)，葉片總酚、總類黃酮、總黃烷-3-醇含量高于對(duì)照，在短時(shí)間內(nèi)外源水楊酸可促進(jìn)植物多酚物質(zhì)積累，這與前人研究結(jié)果[18，25]一致。MINA等[26]在切除的倒刺菠菜葉柄中，用一定范圍的水楊酸濃度（0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L）飼喂，結(jié)果顯示，0.5 mmol/L飼喂8～10 d是最理想的方法。本研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol/L SA孵育1 h是最佳方式，與MIN等[26]的研究結(jié)果不同，原因可能是孵育材料、外界環(huán)境條件的不同導(dǎo)致最佳孵育時(shí)間存在差異。隨SA孵育時(shí)間的增長(zhǎng)，葡萄葉片的總酚含量、總類黃酮含量、總黃烷-3醇含量下降，這可能與離體葡萄葉片自身的生長(zhǎng)代謝有關(guān)。

朱越[27]在葡萄葉片發(fā)育過(guò)程中檢測(cè)到（+）-兒茶素、（-）-表?xiàng)攦翰杷亍ⅲ?）-表兒茶素、（-）-表兒茶素沒(méi)食子酸酯4種黃烷-3-醇單體。在葉片發(fā)育的所有階段，葉片原花青素延伸亞單位組成都是相似的，表兒茶素是主要的亞單位，其次是表?xiàng)攦翰杷兀€有少量的兒茶素和表兒茶素沒(méi)食子酸酯，本試驗(yàn)測(cè)定的葡萄葉片的黃烷-3-醇含量為0.26～1.20 mg/g，與KHAN等[22]和DOWNEY等[28]的結(jié)果相似。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，早黑寶葡萄新鮮葉片中（+）-兒茶素含量最高，（-）-表?xiàng)攦翰杷睾看沃?）-表兒茶素含量最少，這與DANI等[29]的研究結(jié)果類似。而酯化的黃烷-3-醇如（-）-表兒茶素沒(méi)食子酸酯與低聚原花青素在茶樹(shù)葉片中積累到非常高的水平[30]，但在葡萄葉片中含量極小，幾乎檢測(cè)不到，可能是（-）-表兒茶素沒(méi)食子酸酯含量過(guò)小而未達(dá)到儀器檢測(cè)限。

蒸餾水孵育葡萄新梢，兒茶素含量基本處于上下波動(dòng)狀態(tài)，表?xiàng)攦翰杷睾捅韮翰杷睾看笾卤憩F(xiàn)先升高后下降，表?xiàng)攦翰杷睾吭?4 h出現(xiàn)最高峰，而表兒茶素含量在120 h出現(xiàn)最高峰，可能是隨蒸餾水孵育時(shí)間的加長(zhǎng)，葡萄葉片中的無(wú)色花青素合成兒茶素，兒茶素合成原花青素2個(gè)階段均趨于相對(duì)平穩(wěn)狀態(tài)，而部分表?xiàng)攦翰杷叵扔诒韮翰杷睾铣稍ㄇ嗨兀诤笃诒項(xiàng)攦翰杷睾肯扔诒韮翰杷叵陆担敝?40 h后含量趨于平穩(wěn)。

前人研究表明，花青素還原酶（Anthocyanidin reductase，ANR）和無(wú)色花青素還原酶（Leucoanthocyanidin reductase，LAR）對(duì)黃烷-3-醇的合成具有特異性，ANR催化花青素轉(zhuǎn)化為2，3-順式-黃烷-3-醇，即-（-）表兒茶素[31]、（-）-表?xiàng)攦翰杷睾停?）-表兒茶素-3-O-沒(méi)食子酸酯，而LAR催化無(wú)色花青素轉(zhuǎn)化為2，3-反式-黃烷-3-醇，如（+）-兒茶素[32-33]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol/L SA孵育0～240 h內(nèi)，葡萄葉片兒茶素、表?xiàng)攦翰杷亍⒈韮翰杷睾炕靖哂趯?duì)照，其原因可能是，SA激活了葡萄葉片ANR、LAR活性，從而提高了葡萄葉片兒茶素、表?xiàng)攦翰杷丶氨韮翰杷睾俊Ｔ?20 h下，SA對(duì)葡萄葉片兒茶素、表?xiàng)攦翰杷睾刻岣咦蠲黠@，且SA對(duì)表?xiàng)攦翰杷睾康挠绊懽畲螅瑢?duì)兒茶素含量的影響次之，表明SA對(duì)合成表?xiàng)攦翰杷氐拇龠M(jìn)作用大于對(duì)合成兒茶素的促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

外源0.5 mmol/L SA對(duì)葡萄葉片多酚類物質(zhì)積累具有促進(jìn)作用，SA處理短時(shí)間內(nèi)可以促進(jìn)葡萄葉片總酚、總類黃酮、總黃烷-3-醇物質(zhì)的積累。0.5 mmol/L SA促進(jìn)葡萄葉片黃烷-3-醇單體積累，特別是對(duì)兒茶素、表?xiàng)攦翰杷亍⒈韮翰杷睾糠e累具有明顯的促進(jìn)作用，且SA對(duì)合成表?xiàng)攦翰杷氐拇龠M(jìn)作用大于對(duì)合成兒茶素的促進(jìn)作用。