做好窗口期應激管理來降低復產ASF感染風險

楊有福，李 想，譚 輝，畢小娟，劉自逵1,*

（1.湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙 410128；2湖南加農正和生物技術有限公司，湖南 長沙 410329；3.PSY應用研究院，湖南 長沙 410329）

非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）是一種由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）感染引起的，以家豬和野豬為主要宿主的高接觸性傳染、病毒出血性疾病。從2018年8月份傳入國內以來，官方渠道報道近200起，造成國內生豬存欄和豬肉供應“斷崖式”下降。為彌補生豬存欄和豬肉供應的巨大缺口，做好ASF防控前提下的安全復產成為政府和行業的共識并積極落地。

筆者結合非洲豬瘟發病機理研究進展和多起ASF案例的防控經驗和教訓，總結出在豬場安全復產過程中確實存在ASF感染風險激增的節點，包括免疫、發情、配種、分娩、斷奶和轉群等六大風險窗口期，是豬發生應激最多、應激反應最強烈的階段。例如，疫苗免疫特別是肌注疫苗操作對機體的應激最大，會引發窘迫應激、驅趕應激、掙扎應激、痛疼應激和感染應激等；發情、配種是機體激素變化最大的階段，發情時會表現體溫升高、采食量下降、呆立反應、異物反應、排斥反應等應激；分娩是一個極度疲勞、劇烈痛疼和代謝紊亂的過程，是母仔的生死關，其應激反應可想而知；斷奶與轉群對于仔豬的應激特別大，生理應激（從吃奶向吃料轉化，從液體奶水向固體飼料轉變）、環境窘迫（陌生環境、冷熱應激、空間應激）與心理應激（陌生個體、遠離母親、打斗與驚恐）等。深挖其中的機理，我們認為六大風險窗口期造成的豬群應激會引發一系列的生理生化反應，對豬的健康極為不利，往往成為ASF感染風險升高的主要窗口期。文章旨在通過闡述各種應激對豬健康傷害與ASFV感染之間的緊密關系，為復產過程中風險窗口期的應激管控提供理論支持，為豬場安全復產提供行動思路。

1 應激反應的中心是“胃腸道”，直接損壞其黏膜免疫屏障，提高了ASFV的感染風險

豬呼吸道和消化道是ASFV感染豬的主要門戶，ASFV通過扁桃體或背側咽黏膜進入頜下淋巴結或咽后內側淋巴結，以受體介導的“細胞內吞”為主要方式進入靶細胞，在淋巴結復制后通過淋巴液、血液快速擴散至全身[1-4]。

黏膜免疫是豬抵抗ASFV感染的第一道屏障。黏膜免疫系統是機體免疫系統重要的組成部分，包括呼吸道、消化道、泌尿生殖道的黏膜組織，由覆蓋于黏膜系統內表面的黏膜上皮組織、黏膜相關淋巴組織、免疫細胞及其產生的分泌物，以及黏膜正常棲息的微生物構成，是機體與外界抗原直接接觸的門戶，不同部位黏膜免疫反應相關聯形成共同黏膜免疫屏障（CMIS），對機體的免疫應答具有重要的調節作用[5]。SIgA作用于黏膜局部，是黏膜中關鍵因子，對維護黏膜上皮細胞之間的緊密連接，對由于食物攝入或由空氣吸入的某些抗原物質具有封閉作用；SIgA與病毒結合，可阻擋病毒黏附于宿主細胞、中和病毒和病毒產生的毒素，增加黏液蛋白酶對抗原降解等免疫清除作用，避免抗原進入機體，從而避免有某些超敏反應發生。SIgA超高產量、超高免疫清除率，超出了其他所有Ig，能有效防御疾病、維持內環境穩定和防止某些超敏反應與自身免疫病發生。

持續而強烈地應激導致ASFV通過鼻、口侵入呼吸道和消化道黏膜，引發黏膜炎癥，使SIgA由SC介導轉運到消化道、呼吸道和泌尿生殖道能力下降，造成CMIS受損。應激在胃腸道黏膜上表現最為典型，有以下表現。1）交感-腎上腺髓質系統的強烈興奮，引發內臟血管的持續性收縮，導致黏膜缺血、缺氧性損傷、潰瘍與糜爛；2）通過分泌糖皮質激素（GC），抑制黏膜上皮細胞再生；3）通過調節代謝水平，導致細胞內酸性產物增多，細胞酸中毒造成損傷；4）導致氧自由基增多，破壞細胞生物膜通透性。

通過這幾個機理，持續的強烈應激能破壞機體重要黏膜免疫屏障，為病毒感染打開了大門。因此，完整的黏膜免疫屏障對提高感染閾值具有十分重要的意義，維護消化道和呼吸道完整有利于防控ASF。

2 應激提高巨噬細胞CD163表達，促進ASFV感染靶細胞

2.1 CD163是巨噬細胞特異性表達蛋白，可能是ASFV感染的必要不充分條件

ASFV有嚴格的靶細胞趨向性，首要靶細胞是單核細胞和巨噬細胞，也有報道能感染樹突狀細胞[6]。這種細胞趨向性表明ASFV的感染可能需要特定的細胞表面蛋白協助。研究發現，成熟細胞更易受到ASFV的感染，而骨髓細胞和新生的血液單核細胞不易受到感染。通過FACS方法對單核細胞進行分析，發現感染的細胞有更多的成熟表型、有高水平表達幾種巨噬細胞特異性標記以及SLA II抗原[7]。高度成熟的、細胞高水平表達特定標記的巨噬細胞最容易感染ASFV，尤其表達了受體CD163、表面抗原4E9（豬CD107a或溶酶體相關的膜蛋白I）的巨噬細胞更是如此[8]。

ASFV主要通過受體介導的細胞內吞方式進入細胞，然而目前可確信地參與病毒入侵的細胞受體尚不明確[3，9]。CD163是一種巨噬細胞特異性表達的蛋白，其表達的上調是巨噬細胞轉變為活性表型的重要改變之一。CD163是一種血紅蛋白清道夫受體，在溶血過程中能攝取釋放在血漿中的血紅蛋白，并與觸珠蛋白絡合[10]。研究發現，CD163表達的提高、單核細胞成熟度也相應提高，而ASFA感染的百分比也上升。體內的試驗也同樣表現出CD163的表達與病毒感染之間的緊密相關性[7]。CD163在紅髓巨噬細胞、骨髓巨噬細胞、肝巨噬細胞、肺巨噬細胞等高度表達[10]，也是ASFV首選的靶細胞。因此，CD163可能是ASFV的感染受體。也有研究表明，利用基因敲除技術敲除巨噬細胞上的CD163獲得的試驗豬能感染格魯吉亞2007/1毒株（Georgia 2007/1）并表現臨床病癥，與野生型對照組相比并沒有顯著差異；體外感染巨噬細胞試驗也得到了同樣的結果。因此，CD163并不是格魯吉亞2007/1毒株感染的必需受體，其與其他毒株的感染能力差異仍需要進一步研究[11]。然而，通過CD163抗體處理后確實能抑制ASFV對巨噬細胞的綁定。綜合這些研究結果，證明了CD163是ASFV感染的必要不充分條件，ASFV的感染可能還涉及到其他巨噬細胞表面蛋白[12]。

2.2 應激提高CD163分泌，可能是促進ASFV感染的機制之一

機體應激系統包括中樞神經系統中的下丘腦和腦干部位，以及外周的下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸、傳出交感/腎上腺髓質系統和副交感系統。應激系統激活的中樞系統反應是應激性刺激激活下丘腦釋放促腎上腺素釋放因子（CRF），CRF可刺激B細胞增生、激活NK細胞以及增加IL-1、IL-2和IL-6等作用，同時能刺激應激系統外周活性物質GC的分泌。GC為體內重要的抗炎物質，能抑制多種促炎介質的產生，應激發生時會引發多種炎癥，其分泌上升[13,14]。體外試驗結果表明，GC、IL-6和血紅蛋白（Hb）等能刺激CD163的表達，而IFN-γ、IL-4等能抑制CD163的表達。體內試驗也證明，GC能提高CD163的表達[10]，這可能是應激促進ASFV的感染的機制之一。

3 應激誘導血管內粒細胞凝聚，加速了微血栓的形成與內皮細胞損傷，有利于病毒擴散

在細胞培養中，紅細胞會形成一個皇冠狀結構圍繞在感染細胞周圍。在感染豬體內也可以觀察到梨形的紅細胞吸附在感染的巨噬細胞周圍，說明血細胞吸附是ASFV感染的一個特點。吸附是病毒發生感染的前提條件，ASFV在感染血細胞中粒細胞后，會誘導粒細胞凝聚，這可能是因為ASFV誘導粒細胞分泌IL-1和TNF-α，兩者作為中性粒細胞的趨化因子，導致了中性粒細胞的凝聚，這在急性ASFV傳播方面發揮一定作用，同時導致微血栓的形成和內皮細胞受損[16]。血細胞吸附、病毒出芽和病毒顆粒吸附紅細胞存在緊密聯系[15]。

應激可引發機體炎癥響應。應激性刺激可激活下丘腦-垂體-腎上腺皮質軸，促炎癥因子IL-1和TNF-α受誘導分泌增多[13，14]。研究表明，產前分娩應激提高IL-1β和TNF-α的表達[17]，這可能與多胎妊娠動物子宮過度延展引起的機械應激隨后誘導的炎癥有關[18]。仔豬斷奶應激除了影響采食和營養吸收能力外，體內還會蓄積大量的氧自由基。過量的氧自由基能誘導炎癥細胞因子的表達，引起胃腸的炎癥響應。研究發現，與哺乳期仔豬相比，斷奶仔豬的空腸促炎癥因子IL-1β和IL-6表達顯著上升，通過飼喂抗氧化物質，斷奶仔豬的促炎癥因子顯著降低，與哺乳期仔豬無顯著差異[19]。

因此，妊娠后期飼養、分娩與斷奶管理等是養豬生產中的關鍵節點，此時的應激極有可能導致后續的炎癥反應和炎癥因子的分泌，促進ASFV的早期感染與擴散。

4 應激抑制干擾素分泌，幫助ASFV實現免疫逃逸

4.1 ASFV抑制IFN分泌實現免疫逃逸

IFN是抗病毒免疫最重要的早期免疫分子，其中Ⅰ型干擾素（IFN-α、IFN-β）由感染局部的上皮細胞、成纖維細胞和pDC細胞等分泌，而Ⅱ型干擾素（IFN-γ）早期由活化的巨噬細胞和NK細胞分泌，后期由活化的輔助細胞產生。病毒感染時機體產生IFN-α和IFN-β，兩者通過作用于病毒感染細胞和其臨近的未感染細胞，誘導抗病毒蛋白的產生而發揮抗病毒作用。

Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干擾素都能激活NK細胞，促進其殺傷病毒感染細胞。NK細胞是重要的早期抗病毒效應細胞，同時NK細胞還是抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（ADCC）中的效應細胞，通過與感染細胞結合，釋放穿孔素、顆粒酶等細胞毒物質殺傷病毒感染的靶細胞。

干擾素還能激活單核/巨噬細胞系統，增強其吞噬和殺傷功能，在病毒感染早期發揮重要的抗病毒效應。巨噬細胞在IFN-γ刺激下活化，同時促進巨噬細胞產生ROIs和RNIs，幫助殺滅被吞噬的病毒。此外，巨噬細胞也可通過ADCC機制清除病毒。

ASFV通過多種途徑實現免疫逃避，包括細胞趨向性、抑制干擾素分泌、抑制干擾素響應以及抑制感染細胞的凋亡。而抑制干擾素分泌是其中最重要的免疫逃避機制。

為了能夠順利地完成病毒復制和傳播，ASFV通過多種機制抑制感染細胞凋亡。但同時，ASFV也能誘導鄰近的未感染的淋巴組織以及血液B細胞和T細胞大量死亡，從而達到抑制干擾素分泌、抑制免疫響應的目的。其中的機制不明，推測可能是感染的細胞分泌或傳遞表面因子，導致鄰近未感染淋巴細胞凋亡[6]。體外培養的感染細胞中，TNF mRNA表達上升，培養液上清液有高水平的TNF蛋白，這些上清液能引起未感染的淋巴細胞的凋亡；在ASFV感染的豬體內，血清中TNF和IL-1β水平上升，巨噬細胞表達TNF-a、IL-1和IL-6，靠近的淋巴細胞同樣有凋亡現象[20]。

此外，ASFV能編碼多種基因抑制干擾素分泌和干擾素誘導。敲除MGF360和MGF530/505多基因家族中的一個或多個成員能顯著提高對Ⅰ型干擾素的誘導和Ⅰ型干擾素誘導的下游基因的表達[6,8,21]，表明這兩個基因家族是在抑制干擾素分泌和干擾素誘導中扮演至關重要的角色。例如MGF505-7R通過抑制干擾素調控因子IRF3R和NF-kB信號通路轉導，抑制Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干擾素表達；MGF360-15R（A276R）通過TLR3和胞質傳感通路抑制Ⅰ型干擾素；ASFV pI329L蛋白與細胞內的TLR3相似，它是一種糖基化蛋白分泌在細胞膜上，通過競爭抑制TLR3調控的IFN-β的誘導[6]。

因此，在早期感染階段ASFV通過誘導未感染免疫細胞凋亡、抑制干擾素分泌和抑制干擾素響應等方式，造成對免疫系統的抑制，實現免疫逃逸，保障病毒的順利復制和擴散。

4.2 應激導致免疫抑制有利于ASFV實現免疫逃逸

短暫的急性應激能導致免疫反應增強，如外周血巨噬細胞數目增多，但高度成熟、分泌高水平CD163的巨噬細胞反而成了感染靶細胞。同時，持續的應激可抑制免疫功能。一方面應激時的內分泌調節會抑制免疫系統，如GC對免疫功能有抑制作用；另一方面，應激造成的氧自由基、促炎癥因子增多，會直接損傷免疫細胞，導致免疫細胞數量下降、干擾素分泌不足，導致免疫抑制。應激造成的免疫抑制為ASFV的早期感染提供了安全的環境[22]。

總之，在發情、配種、分娩、斷奶、轉群和免疫這六大窗口期非常容易出現程度不同的應激以及應激性反應，引發消化道與呼吸道的共同黏膜免疫屏障的損傷、潰瘍或糜爛，促進巨噬細胞表達特異性細胞表面蛋白CD163與炎癥趨化因子（IL-1、TNF-α、IL-6）表達，誘導血管內粒細胞凝聚及微血栓形成與內皮細胞損傷，抑制干擾素分泌、抑制免疫反應等方式，成為ASF防控的風險“激增期”，為ASFV的入侵、成功感染和早期復制提供有利的環境，這極大增加了豬場ASF的防控風險。因此，做好豬群應激管理、做好六大窗口期風險管控是減少豬場感染風險、成功復產的關鍵措施。