麩炒枳殼配方顆粒特征圖譜研究

徐以亮

(江陰天江藥業有限公司，江蘇 江陰 214434)

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL．及其栽培變種的干燥未成熟果實，具有理氣寬中、行滯消脹之功效，用于胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化等癥。2010年版《中國藥典(一部)》中主要采用柚皮苷和新橙皮苷的含量來評價枳殼藥材的質量[1]。有關枳殼藥材及飲片的質量控制方法，已有相關文獻報道[2－4]。麩炒枳殼配方顆粒為枳殼藥材經現代制劑技術制成的顆粒劑，為有效控制其內在質量，筆者采用高效液相色譜(HPLC)法對11批麩炒枳殼配方顆粒進行測定，初步建立了麩炒枳殼配方顆粒HPLC特征圖譜，共確定4個特征峰，現報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);AT－330型柱溫箱(天津奧特賽恩斯科學儀器有限公司);超聲清洗機(無錫超聲電子設備廠);電子天平(瑞士梅特勒公司)。柚皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110722－200309);新橙皮苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為111857－201102);麩炒枳殼配方顆粒(江陰天江藥業有限公司，批號分別為 0710142、0712057、0805132、0807181、0809038、0901062、0904034、0909004、0912080、1008088、1010079，分別編號為 S1 ～S11);乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱:Megres5－C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動相:乙腈(A)和4%冰醋酸水溶液(B)，二元梯度洗脫65 min，0～5 min時，5% ～10%A(V/V)，5～20 min時，10% ～35%A(V/V)，20～40 min時，35% ～65%A(V/V)，40～60 min 時，65% ～100%A(V/V)，60～65 min時，100% ～5%A(V/V);流速:1．0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:280 nm;進樣量:10 μL。在此色譜條件下，對照品及樣品中各色譜峰均獲得了較好分離(圖1)。

圖1 高效液相色譜圖

2．2 溶液配制

精密稱取柚皮苷對照品6 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成柚皮苷對照品溶液。精密稱取新橙皮苷對照品2．5 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成橙皮苷對照品溶液。精密稱取預先粉碎的麩炒枳殼配方顆粒0．1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質量，加甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0．45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2．3 方法學考察

精密度試驗:取同一批樣品(批號為1008088)，按2．2項下方法制備成供試液，進樣5次。以3號峰為參照峰，計算其他各峰的相對保留時間和相對峰面積。結果各特征峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，相似度大于0．997 8，RSD低于3%(n=5)，符合中藥高效液相指紋圖譜的檢驗要求。

重現性試驗:取同一批樣品(批號為1008088)共5份，分別制備供試品溶液并依法測定。以3號峰為參照峰，計算其他各峰的相對保留時間和相對峰面積。結果各特征峰的相對保留時間和相對峰面積基本一致，相似度大于0．99，RSD低于3%(n=5)。

穩定性試驗:取同一供試品溶液，分別在制備后0，6，12，24，48 h時進樣測定。以3號峰為參照峰，計算其他各峰的相對保留時間和相對峰面積。結果各特征峰的相對保留時間和相對峰面積亦基本一致，相似度大于0．99，RSD低于3%(n=5)，表明供試品溶液在48 h內穩定。

2．4 樣品測定

分別按2．2項下方法制備供試品溶液并測定11批樣品的HPLC圖譜。比較記錄的色譜圖，并將處理結果導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)”進行分析。

2．5 高效液相特征圖譜的構建

特征峰確定:采用相對保留時間標定共有指紋峰，即以柚皮苷為參照物(S)，將各色譜峰保留時間與同一圖譜中參照物的保留時間相比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間。分別計算11批樣品特征圖譜中各色譜峰的相對保留時間和峰面積，其中4個色譜峰為11批樣品所共有，其特征峰的相對保留時間為峰 1(0．90)、峰 2(0．97)、峰 3(1．00)、峰 4(1．05)。峰 3 為柚皮苷(S)，峰4為新橙皮苷。因此，標定這4個色譜峰為共有特征峰(圖 2)。

圖2 11批麩炒枳殼配方顆粒的共有特征峰

特征圖譜相似度評價:將所得到的色譜數據導入國家藥典委員會指定的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2004A版)”，設定參照圖譜，采用多點校正將譜峰自動匹配，然后生成對照圖譜，進行相似度評價，結果見圖3和表1。從表1中可以看出，11批樣品的相似度均在0．95以上，說明該11批枳殼配方顆粒的差別很小。

圖3 11批麩炒枳殼配方顆粒的特征圖譜

與枳殼藥材的相關性驗證:將麩炒枳殼配方顆粒的特征圖譜與枳殼藥材的水煎液的液相圖譜進行比較(圖4)。結果表明，麩炒枳殼配方顆粒中的特征峰與枳殼藥材水煎液色譜峰能夠一一對應。

3 討論

供試液制備過程中，曾采用不同溶劑(甲醇、50%甲醇、70%乙醇、稀乙醇)進行比較，結果以甲醇和稀乙醇超聲提取30 min所得溶液的色譜峰較多。通過對主要色譜峰理論板數的比較，采用甲醇提取所得供試液的分離效果優于稀乙醇提取所得供試液，因此采用甲醇作為提取溶劑。

表1 11批麩炒枳殼配方顆粒樣品的相似度

圖4 麩炒枳殼配方顆粒與枳殼藥材相關性驗證圖

采用DAD檢測器記錄麩炒枳殼配方顆粒樣品溶液在190～400 nm的3D吸收圖，發現檢測波長為280 nm時譜圖中出現的色譜峰最多，且分離度良好，因此選擇280 nm作為檢測波長。

篩選了乙腈－水、乙腈－0．1%冰醋酸、甲醇－0．1%冰醋酸、乙腈－4%冰醋酸、乙腈－1%冰醋酸、乙腈－0．1%磷酸等系統組成的流動相，最終確定以乙腈－4%冰醋酸水溶液進行梯度洗脫，所得基線平穩，色譜峰峰型，分離度高。比較了Megres5－C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm)、Lichrospher－C18柱(200 mm ×4．6 mm，5 μm)及 ZORBAX Eclipse XDB －C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm)的分離效果，結果前者分離效果理想。此外，還考察了不同流速及柱溫對分離效果的影響，結果表明，柱溫為30℃，流速為0．8 mL/min時樣品的分離效果較好。

從所得特征圖譜的分析結果來看，本試驗各批樣品的相似度較高，均一性較好。各共有峰的相對保留時間較穩定，具有專屬性，可用于鑒別麩炒枳殼配方顆粒的真偽，為今后麩炒枳殼配方顆粒生產過程的質量控制提供了檢測依據。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京:中國醫藥科技出版社，2010:229－230．

[2]王發英，徐 歡，楊武亮，等．枳殼質量標準研究[J]．中成藥，2009，31(12):1 897－1 901．

[3]王少軍，曹 君，楊武亮，等．枳殼生飲片的HPLC指紋圖譜研究[J]．中草藥，2005，36(11):1 646 －1 648．

[4]趙 宇，謝培山，梁逸曾，等．中藥枳殼HPLC指紋圖譜分析及化學模式識別分類研究[J]．中國藥學雜志，2005，40(11):812－815．