質量分數25%滴酸·氨氯吡水劑對薇甘菊生理生化特征影響及防除效果研究

宋雪 ，王輝，伍洲洲，昝欣，胡長云，昝啟杰 *

1. 深圳大學生命與海洋科學學院，廣東 深圳 518060；2. 深圳中綠環境集團有限公司，廣東 深圳 518060；3. 深圳小洲生態環境有限公司，廣東 深圳 518101

薇甘菊（Mikania micrantha）是菊科（Asteraceae）假澤蘭屬（Mikania）多年生草質藤本，原產于熱帶美洲，是對自然生態系統造成嚴重破壞和對經濟造成重大損失的最有害100種外來入侵物種之一（張國云，2013）。近年來，薇甘菊已在香港、廣東、福建、廣西、云南等地區迅速蔓延（李鳴光等，2012）。在冬季薇甘菊葉片和莖中花青素的積累提高了其對低溫環境的適應性（Zhang et al.，2019）。薇甘菊通過在夜間吸收CO2來實現更高的光合作用能力，以補充白天碳的固定，并增強莖的光合作用效率，利于其更廣泛的分布和危害。另外，它的代謝物通過富集參與氮循環途徑的微生物來增加氮的利用率。而且分析薇甘菊染色體的規模參考基因組，發現其全基因組和部分片段重復（Liu et al.，2020）。因此，尋找防除效果好且成本低廉的薇甘菊防治方法，已是迫在眉睫。

氨氯吡啶酸屬于吡啶類除草劑，具有高效、低毒、選擇性強，內吸傳導性強，對非靶標植物安全等特點，對闊葉類雜草有優良防除效果，目前在林業以及草原等非農田地區廣泛應用（于紅妍等，2017）。此類除草劑屬內吸性除草劑，施藥后被植物的葉片或根部迅速吸收，然后在植物體內進行傳導，造成細胞分裂的失控和無序生長，最后導致維管束被破壞，也能夠抑制細胞的分裂和生長（于紅妍等，2017）。2, 4-滴屬于苯氧羧酸類除草劑，單獨使用較高濃度的2, 4-滴不能徹底殺滅薇甘菊，但該藥劑對禾本科植物安全（趙丹陽等，2012；黃茂俊等，2013）。吡啶類除草劑對闊葉雜草效果顯著，苯氧羧酸類除草劑對禾本科植物較為安全，目前尚未有氨氯吡啶酸和 2, 4-滴復配除草劑防治薇甘菊的報道。

本文以 25%滴酸·氨氯吡水劑（有效活性成分為質量分數ω=25%的2, 4-滴和氨氯吡啶酸，以下簡稱為“25%滴酸·氨氯吡水劑”）為試驗藥劑，以常用除草劑ω=24%的滴酸·二氯吡水劑（商品名為“紫薇清”，有效活性成分為ω=24%的2, 4-滴和二氯吡啶酸）和70%嘧磺隆水溶性粉劑（商品名為“森草凈”）為對照藥劑進行防除薇甘菊的試驗。通過本研究，初步篩選出防治薇甘菊的最佳劑量，并探討該劑量下除草劑對薇甘菊生理生化指標的影響，了解除草劑造成薇甘菊枯死的機理，以期減少除草劑對生態環境的影響，為科學合理防治薇甘菊提供更多可選擇的技術及理論支持。

1 材料與研究方法

1.1 篩選不同劑量的除草劑最佳劑量試驗設計

1.1.1 研究地概況

深圳位于廣東省中南沿海地區，屬亞熱帶海洋性氣候。其福田區年平均氣溫22.55 ℃，年平均降雨量1926.80 mm，年平均相對濕度79%（劉俊武等，2010）。植被主要以天然次生林、人工林、經濟果林等為主，綠地面積 3429 hm2，林木綠化率為42.2%（劉俊武等，2010）。本課題組在深圳市福田區進行野外薇甘菊防除試驗。試驗區植被蓋度在90%以上，其中薇甘菊蓋度約70%，其余植物蓋度約30%。試驗區主要植物種類有薇甘菊Mikania micrantha、鬼針草Bidens pilosa、馬纓丹Lantana camara、肖梵天花Urena lobata、蔓生莠竹Microstegium fasciculatum、龍珠果Passiflora foetida、南美蟛蜞菊Sphagneticola trilobata、五爪金龍Ipomoea cairica、葛Pueraria montana、雞矢藤Paederia foetida等。

1.1.2 樣地設置與施藥方法

2017年9月，選擇向陽坡地的草叢作為研究樣地。設置4 m2的樣方（每個樣方彼此獨立），每個樣方3個重復。在薇甘菊生長旺盛期，采用手動式噴霧器（15 L）均勻定向噴灑藥液至樣地內所有植物的葉面、莖稈上。施藥當天晴天，施藥時溫度28—32 ℃，無風，噴藥后48 h未降雨。

以紫薇清和森草凈為對比，采用 25%滴酸·氨氯吡水劑防除薇甘菊。25%滴酸·氨氯吡水劑和紫薇清的劑量分別為 100、200、300、400 mL·hm-2（有效成分 25、50、75、150 g·hm-2），森草凈的劑量為 35、70、100、150 g·hm-2（有效成分 25、50、75、150 g·hm-2），每個處理均設3次重復，初步篩選出 25%滴酸·氨氯吡水劑防除薇甘菊的最佳劑量。為了進一步探究除草劑對薇甘菊的生理生化的影響，以 25%滴酸·氨氯吡水劑的最佳劑量進行薇甘菊防除試驗，并設置了1個不施藥的樣地作為對照。用手持式噴霧器噴藥，噴液量為3 L·hm-2。所設濃度參考《森草凈防除薇甘菊-對植物多樣性的影響與敏感性及土壤殘留量》（孫延軍，2005）。

1.1.3 藥效調查

在施藥后0、4、11、18 d調查薇甘菊的蓋度。為了進一步了解除草劑作用于薇甘菊產生癥狀的特征以及完全殺滅薇甘菊的最短時間，以 25%滴酸·氨氯吡水劑的最佳劑量噴施薇甘菊，施藥后0、4、7、21 d調查薇甘菊的蓋度。

1.1.4 數據處理

根據調查結果計算噴藥后薇甘菊的殺滅率。運用Excel進行處理數據，SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）比較不同藥劑對薇甘菊的殺滅率（%）。計算公式如下：

式中，P表示薇甘菊殺滅率（%）；A表示噴藥前薇甘菊的蓋度；B表示噴藥后薇甘菊的蓋度。

1.2 薇甘菊生理生化指標測定

1.2.1 植物組織樣品的采集

采用 25%滴酸·氨氯吡水劑的最佳劑量噴施薇甘菊，于噴藥后4 d和7 d，采集一年生長勢基本一致的薇甘菊葉片15片，每個處理3個重復，用冰盒帶回，測葉綠素含量、可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性。

1.2.2 葉綠素a、b的含量測定

葉綠素a（Chla）和葉綠素b（Chlb）測定采用張憲政（1992）的丙酮-乙醇混合液法，用打孔器取新鮮葉片0.1 g至于15 mL離心管中，加入10 mL丙酮-乙醇提取液（80%丙酮∶乙醇=1∶1），搖勻后，置于黑暗處浸泡12 h，使葉片組織變白后在紫外分光光度計分別測定波長為663 nm和645 nm時的OD值，計算葉綠素a、葉綠素b的含量。

1.2.3 可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性測定

可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創木酚法；過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外吸收法。以上植物樣本可溶性蛋白含量和抗氧化酶活性含量測定的具體操作參照南京建成試劑盒說明書。

1.2.4 數據分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），分析不同時間不同藥劑對薇甘菊葉片生理生化指標的的影響。用 GraphPad Prism 5.0作圖。

2 結果與分析

2.1 除草劑防除薇甘菊的效果

從表1可知，隨著噴藥時間的增加，除草劑對薇甘菊的防治效果越明顯；隨著除草劑劑量加大，殺滅率越高，防除效果越好。施藥4 d后，300—400 mL·hm-225%滴酸·氨氯吡水劑對薇甘菊殺滅率顯著高于100—200 mL·hm-225%滴酸·氨氯吡水劑；不同處理組的紫薇清對薇甘菊的殺滅率無明顯區別；高劑量的150 g·hm-2森草凈對薇甘菊殺滅率僅為 24.92%，且殺滅率顯著低于同等劑量的 25%滴酸·氨氯吡水劑。施藥11 d后，25%滴酸·氨氯吡水劑對薇甘菊的殺滅率為 80.78%—96.22%，不同處理組無顯著變化；紫薇清對薇甘菊的殺滅率為68.26%—98.67%，100 mL·hm-2的紫薇清對薇甘菊的殺滅率顯著低于為 200—400 mL·hm-2的紫薇清處理組；35 g·hm-2森草凈對薇甘菊的殺滅率顯著低于其余處理組。施藥18 d后，低劑量的100 mL·hm-225%滴酸·氨氯吡水劑和紫薇清對薇甘菊殺滅率分別為95.87%和86.35%，殺滅率顯著高于同等劑量的森草凈；200 mL·hm-225%滴酸·氨氯吡水劑和紫薇清對薇甘菊的殺滅率為98.57%和97.22%，顯著高于森草凈處理組。由此可見，施藥 18 d，200 mL·hm-2的 25%滴酸·氨氯吡水劑和紫薇清對薇甘菊殺滅效果較好。

為了了解除草劑作用于薇甘菊產生癥狀的特征及完全殺滅薇甘菊的最短時間，分析了同等劑量的除草劑（200 mL·hm-225%滴酸·氨氯吡水劑、紫薇清和70 g·hm-2森草凈）對薇甘菊的防除薇甘菊的試驗結果，見表2。噴藥4 d后，25%滴酸·氨氯吡水劑和紫薇清對薇甘菊殺滅率明顯高于森草凈，主要表現為25%滴酸·氨氯吡水劑和紫薇清的樣地內大部分薇甘菊葉片萎蔫、發黃，莖倒伏，森草凈樣地內薇甘菊葉片輕微萎蔫、發黃。噴藥僅 7 d，25%滴酸·氨氯吡水劑和紫薇清對薇甘菊的殺滅率達74.29%—81.40%以上，但森草凈對薇甘菊的殺滅率僅有37.82%，主要表現為25%滴酸·氨氯吡水劑和紫薇清的樣地內為大部分薇甘菊莖葉失水干枯，森草凈樣地內薇甘菊的頂端嫩葉、嫩莖干枯，大部分葉片極度發黃。噴藥21 d，25%滴酸·氨氯吡水劑完全殺滅薇甘菊，紫薇清對薇甘菊的殺滅率為98.57%，森草凈對薇甘菊殺滅率僅為59.40%。由此可見，200 mL·hm-225%滴酸·氨氯吡水劑對薇甘菊防除效果和紫薇清相當，顯著優于森草凈。因此，進一步分析 200 mL·hm-225%滴酸·氨氯吡水劑對薇甘菊葉片生理生化的影響。

表1 除草劑對薇甘菊的防除效果Table 1 The control effect of herbicides to M. micrantha

表2 同等劑量的除草劑對薇甘菊防除效果Table 2 The control effect of the same dose of herbicides on M. micrantha

圖1 除草劑對薇甘菊葉綠素和可溶性蛋白含量的影響Fig. 1 Effect of herbicides on chlorophyll and soluble protein of M. micrantha

2.2 薇甘菊化學防除對薇甘菊生理生化的影響

2.2.1 除草劑對薇甘菊葉綠素的影響

如圖1所示，噴藥7 d，3種除草劑處理薇甘菊葉綠素 a的含量明顯低于噴藥 4 d的處理組（P＜0.05）。藥后4 d，3種除草劑引起葉綠素含量下降，但不存在顯著性差異。藥后7 d，3種除草劑處理的葉綠素a的含量顯著低于對照（P＜0.05），紫薇清和森草凈處理的葉綠素b的含量顯著低于對照（P＜0.05），但25%滴酸·氨氯吡水劑、紫薇清和森草凈處理的薇甘菊葉綠素a和葉綠素b的含量無顯著差異。噴藥7 d，與對照相比，25%滴酸·氨氯吡水劑、紫薇清和森草凈處理的葉綠素 a含量分別降低了51.38%、75.07%和59.65%，3個處理組葉綠素b含量分別降低了31.39%、58.60%和52.73%。

2.2.2 除草劑對薇甘菊可溶性蛋白的影響

如圖1所示，噴藥7 d，紫薇清處理薇甘菊可溶性蛋白的含量明顯低于噴藥4 d的紫薇清處理組（P＜0.05）。藥后4 d，25%滴酸·氨氯吡水劑、紫薇清和森草凈處理薇甘菊，薇甘菊可溶性蛋白含量無明顯變化。噴藥7 d后，25%滴酸·氨氯吡水劑處理組的可溶性蛋白含量顯著低于對照組（P＜0.05），紫薇清和森草凈處理薇甘菊可溶性蛋白的含量與對照組比無明顯差異。25%滴酸·氨氯吡水劑、紫薇清和森草凈處理可溶性蛋白的含量比對照組分別下降了68.84%、58.41%和34.31%。

2.2.3 除草劑對薇甘菊過氧化物酶的影響

從圖2可知，噴藥7 d，25%滴酸·氨氯吡水劑和紫薇清處理薇甘菊POD的活性明顯高于噴藥4 d的25%滴酸·氨氯吡水劑和紫薇清處理組（P＜0.05）。藥后4 d，25%滴酸·氨氯吡水劑、紫薇清和森草凈處理后，薇甘菊POD活性無明顯差異。藥7 d后，25%滴酸·氨氯吡水劑和紫薇清處理的POD活性與對照相比，明顯升高（P＜0.05）。25%滴酸·氨氯吡水劑處理組的 POD活性明顯高于紫薇清處理組（P＜0.05），紫薇清處理薇甘菊的POD活性明顯高于森草凈處理組（P＜0.05），森草凈處理組和對照組的POD活性差異不顯著。25%滴酸·氨氯吡水劑、紫薇清和森草凈處理的POD活性比對照組分別提高了69.58%、59.18%和32.59%。由此可以說明，25%滴酸·氨氯吡水劑對POD活性有顯著影響。

圖2 除草劑對薇甘菊過氧化物酶和過氧化氫酶的影響Fig. 2 Effect of herbicides on POD and CAT of M. micrantha

2.2.4 除草劑對薇甘菊過氧化氫酶的影響

從圖2可以看出，噴藥7 d，3種除草劑處理薇甘菊 CAT的活性明顯高于噴藥 4 d的處理組（P＜0.05）。藥后4 d，25%滴酸·氨氯吡水劑處理薇甘菊，薇甘菊的 CAT活性顯著高于其余處理組（P＜0.05），說明薇甘菊 CAT的活性對除草劑比較敏感。藥后7 d，25%滴酸·氨氯吡水劑處理組CAT活性明顯高于紫薇清處理組（P＜0.05），其次，紫薇清處理組的 CAT活性高于森草凈處理組（P＜0.05）。噴藥7 d后，與對照組相比，25%滴酸·氨氯吡水劑、紫薇清和森草凈處理的CAT活性分別提高了87.55%、81.28%和69.22%，由此可見，25%滴酸·氨氯吡水劑對CAT活性有顯著影響。

3 討論

3.1 除草劑對薇甘菊防除效果

以紫薇清和森草凈為對比，采用 25%滴酸·氨氯吡水劑防除薇甘菊。試驗結果表明，施藥后21 d，200 mL·hm-225%滴酸·氨氯吡水劑和紫薇清對薇甘菊殺滅率分別為100%、98.57%，但70 g·hm-2森草凈對薇甘菊殺滅率不好，殺滅率低于78%。孫延軍（2005）在內伶仃島針對森草凈對薇甘菊殺滅效果進行研究，結果表明，在坡地100 g·hm-2森草凈防除薇甘菊的復發率為20%左右。使用2, 4-D鈉鹽和2, 4-D丁酯兩種苯氧羧酸類除草劑對薇甘菊有極好的滅生性，但苯氧羧酸類除草劑抗藥性明顯增強，薇甘菊逐漸恢復生長（黃華枝等，2004）。另有學者施用紫薇清來防治非耕地生長的薇甘菊，發現使用 1200 mL·hm-2紫薇清對薇甘菊的防除效果為96.4%（張暉等，2012），這與黃茂俊等（2013）研究結果一致，只能殺滅薇甘菊的地上營養體，不能徹底殺死薇甘菊的根部。在雜草生長旺期噴施1500—2250 g·hm-2304 g·L-1氨氯吡啶酸 2, 4-滴水劑防除非耕地一年生闊葉雜草效果好（陳慶華等，2012）。該結果與本文得出的結果比較吻合，且本研究所施用除草劑劑量遠遠低于氨氯吡啶酸 2, 4-滴水劑。施用 20%氨氯吡啶酸·二氯吡啶酸·烯草酮可分散油懸浮劑防除油菜田雜草效果顯著，總草鮮重防效可達 88.7%—98.0%，顯著優于 30%二氯吡啶酸和24%氨氯吡啶酸水劑（朱文達等，2019）。由此看出，復配藥劑能提高實際防治效果，同時也能夠解決農藥單劑應用過程中成本和抗性等問題（朱文達等，2019）。本文通過多次試驗，篩選出25%滴酸·氨氯吡水劑防除薇甘菊的最低濃度為200 mL·hm-2，該濃度低于前人文獻報道的劑量。

3.2 除草劑對薇甘菊生理生化的影響

除草劑的作用機理分為抑制光合作用、干擾蛋白質、脂肪酸合成以及干擾激素平衡等（陳秋英，2010）。一些除草劑本身作為植物生長調節劑，其除草機制是能夠改變植物生長代謝，在植物體內殘留期較長，可通過作用于敏感植物的生理、生化代謝等方面而防治雜草（劉井蘭等，2006）。葉綠素是高等植物光合作用的主要色素，一定程度反映光合速率的大小。葉綠素含量有時被作為植物抗性的指標之一，評價環境污染物（如除草劑）對植物的影響（Marwood et al.，2001）。除草劑處理后植物葉片會使植物葉綠素a、b含量降低（Wang et al.，2010；Wang et al.，2011）。本研究表明，藥后7 d，3種除草劑與未噴藥的對照組比較，使薇甘菊葉綠素a的含量明顯降低，25%滴酸·氨氯吡水劑對葉綠素b的含量影響不明顯，表明這3種除草劑主要通過降低葉綠素a的含量來降低葉綠素。文獻報道，藥后9 d，48%滅草松水劑1倍推薦量及10%草甘膦水劑1倍推薦量處理葉綠素含量與對照相比顯著降低（彭俊等，2013）。草甘膦、撲草凈和三氟啶磺隆混合使用處理6 d導致棉花、龍葵的葉綠素含量下降（陳秋英，2010），這與本文得出的研究結論基本一致。葉綠素降低的原因可能是薇甘菊細胞膜破壞，活性氧的積累，葉綠素分解加快，而葉綠素的破壞會導致薇甘菊的光合作用受阻，導致葉片衰老（沈燕等，2007）。植物可溶性蛋白含量可作為植物應對脅迫的指標，其含量的大小直接或間接影響植物的代謝情況，反映除草劑對植物的傷害程度（Zhang et al.，2004）。本文結果表明，在噴施25%滴酸·氨氯吡水劑7 d后，薇甘菊可溶性蛋白的含量與對照組相比顯著減少，但紫薇清和森草凈對薇甘菊的可溶性蛋白的含量與對照組相比無明顯差別。由此可見，25%滴酸·氨氯吡水劑對薇甘菊傷害程度稍微大于紫薇清和森草凈。可溶性蛋白減少的原因是 25%滴酸·氨氯吡水劑破壞了薇甘菊葉片中的細胞膜，使得細胞內可溶性蛋白含量減少。植物對不良環境（或逆境）的抵抗能力是通過活性氧清除系統來完成的。POD和CAT是植物體內活性氧清除系統的抗氧化酶，對細胞膜保護起著重要作用（曾小康等，2017）。本文中薇甘菊葉片中的活性氧系統受到3種除草劑影響，藥后7 d，POD和CAT活性顯著高于對照組。文獻報道，藥后10 d，2, 4-D處理下燕麥的CAT和POD活性顯著高于對照組（宋旭東，2015），這與本文得出的結果較吻合。活性氧系統受到影響的原因是除草劑進入植物體內激發了活性氧清除系統，啟動了自我保護機制，產生更多的H2O2，誘導POD和CAT的活性升高，以清除體內過多的 H2O2，免受除草劑的傷害（宋旭東，2015）。本文25%滴酸·氨氯吡水劑處理組的POD和CAT活性升高最快，側面反映了薇甘菊受到 25%滴酸·氨氯吡水劑的毒害作用大，薇甘菊需產生過多的活性氧來達到解毒作用。因此，25%滴酸·氨氯吡水劑對薇甘菊的毒害作用主要是通過減少葉綠素a的含量，干擾蛋白質的合成，破壞活性氧的平衡來完成。

4 結論

本文選取100—400 mL·hm-225%滴酸·氨氯吡水劑、紫薇清和森草凈開展薇甘菊的防除試驗及除草劑對薇甘菊生理生化特征影響的研究。從防治效果來看，200 mL·hm-225%滴酸·氨氯吡水劑和紫薇清對薇甘菊的防治效果顯著優于森草凈，僅噴藥21 d，25%滴酸·氨氯吡水劑對薇甘菊殺滅率達 100%，紫薇清對薇甘菊殺滅率達 98.57%。從生理生化指標來看，噴藥4 d后，25%滴酸·氨氯吡水劑對薇甘菊的CAT活性有顯著影響，對其他生理生化指標無明顯影響。噴藥7 d后，3種除草劑對薇甘菊葉綠素a的含量有明顯影響，25%滴酸·氨氯吡水劑顯著降低了薇甘菊葉片可溶性蛋白的含量。薇甘菊體內活性氧系統POD、CAT活性明顯受到除草劑影響，影響程度表現為：25%滴酸·氨氯吡水劑＞紫薇清＞森草凈＞對照組。因此，通過25%滴酸·氨氯吡水劑能夠對薇甘菊達到顯著的防除效果，該藥劑對薇甘菊的殺滅作用主要通過降低葉綠素a的含量，影響蛋白質的合成以及葉片內活性氧系統來完成。建議在薇甘菊危害較嚴重的區域采用200 mL·hm-225%滴酸·氨氯吡水劑防除薇甘菊。