藥用植物根際細菌群落多樣性驅動因素分析

李毳，劉怡，劉晉仙

1.山西財經大學資源環境學院，山西 太原 030006；2.山西大學黃土高原研究所，山西 太原 030006

植物根際是土壤-植物生態系統物質交換的活躍界面，生物種類和數量繁多，被認為是地球上最復雜的生態系統之一。植物與其根際微生物群落的關系是近年來生態學領域研究的一個熱點問題（尹華軍等，2018）。活躍的根際微生物被喻為植物的第二套基因組，在植物的生長發育過程中發揮著關鍵作用。植物-土壤微生物的相互作用對植物的生長、種間和種內的競爭優勢產生一定的影響（王茜等，2015），植物根際微生物群落具有高度的物種特異性（Pendergast et al.，2013）。那么，是植物決定了其特定的根際微生物群落，還是土壤微生物決定地上植物群落特征？是近年來群落生態學領域期待回答的科學問題。植物與土壤微生物的相互作用改變植物根際和葉際的化學特征，通過葉際和根系分泌物影響植物與植物之間的競爭關系。植物作為微生物碳源的提供者，對土壤微生物群落具有重要的影響（Badri et al.，2009）。另一方面，土壤微生物通過養分循環，為根系提供有效養分，影響根系的生長、代謝和化學特征，提高植物的抗性和生長活力（Eisenhauer et al.，2012）。藥用植物根莖葉中的各類代謝物或次生代謝物是中藥藥理的主要成分，植物的根際和葉際微生物可能對這些代謝物的產生有一定的促進或抑制作用，而這些物質也可能對微生物群落產生影響。因此，研究中藥材植物根際微生物群落的特征和形成機制，以及植物與微生物群落的特異性關系，有助于揭示藥用植物藥理和道地性的形成機制。

本研究選取山西省廣泛分布的黨參（Codonopsis pilosula）、柴胡（Bupleurum chinense）和遠志（Polygala tenuifolia）3種野生道地藥材為研究對象，探討其根際土壤細菌群落的結構與多樣性及其驅動因子。

1 材料和方法

1.1 研究區域和采樣點的設置

山西是全國道地藥材重要產區之一，有著豐富的中藥材資源。在查閱資料和實地調查的基礎上，選取太行山腹地的長治市武鄉縣石圪垤村為研究樣地，地理坐標為 113°60′E，36°44′N。2018 年 5 月12日，在地表植被基本均勻的溝坡草叢或灌草叢中，選擇5年左右株齡、長勢基本一致的野生黨參、柴胡和遠志，每種采集3株，間距大于100 m，共9株。根據 Courchesne根際區土壤取樣方法（Courchesne et al.，1997），沿藥材基部挖取健康根系，抖落根部附著的疏松土壤，留下與根系結合緊密的、大約附著根系1 mm左右的土壤，密封于無菌塑料袋，置車載冰箱保存。帶回實驗室后，將每個物種的3個根際土混合均勻，將土樣中可見的土壤動物及植物殘體過0.2 mm篩去除。樣品一部分風干處理，用于測定土壤理化性質，一部分提取土壤微生物基因組DNA，用于高通量測序。

1.2 土壤理化性質測定

用vario MACRO cube（Germany）元素分析儀測定土壤全碳（TC）、全氮（TN）、全硫（TS）；用CleverChem 380間斷化學分析儀測定土壤硝態氮（NO3-N）、亞硝態氮（NO2--N）、銨態氮（NH4+-N）；用2.5∶1的水土比電極法測定土壤pH值，用烘干法測定土壤含水率。脲酶活性的測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，其活性以37 ℃下培養24 h后1 g土壤產生的NH3+-N的mg數表示；蔗糖酶活性測定采用3, 5-二硝基水楊酸比色法，其活性以37 ℃培養24 h后1 g土壤產生的葡萄糖的mg數表示；過氧化氫酶活性采用KMnO4滴定法，其活性以20 min內每g土壤分解的過氧化氫的mg數表示。

1.3 土壤細菌群落分析

每種藥材的土壤樣品取 3個，每個樣品稱取 5 g，送至北京百邁客生物科技有限公司進行高通量測序（Illumina MiSeq）。用引物 338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）擴增細菌核糖體16S RNA基因的v3—v4高變區，以97%的序列相似性，鑒定細菌的操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），用于細菌群落結構和多樣性分析。

1.4 數據分析

利用單因素方差分析（SPSS 23.0 One-way analysis）和多重比較，分析樣地間土壤理化變量間的顯著性差異（P＜0.05）。利用 Mothur（version v.1.30）軟件，計算樣品的Alpha多樣性指數，包括Shannon多樣性指數、Simpson優勢度指數、ACE指數、Chao1指數、Coverage指數。利用 R語言 V 3.5.1進行相關性分析、冗余分析、方差分解及零模型分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質分析

遠志、柴胡、黨參3種植物根際土壤理化性質的分析結果如圖1所示，土壤酸堿度、總碳、總硫、土壤粒度、脲酶和蔗糖酶活性在不同植物的根際土間差異顯著，而土壤含水率、總氮、銨態氮、硝態氮、過氧化氫酶活性的差異不顯著。所有土壤樣品均呈弱堿性（pH＞7），黨參根際土的 pH 值最大（7.80）。柴胡根際土中總氮、總硫和總碳均為最大，分別為 0.13、0.051、2.91 mg·kg-1。土壤脲酶和蔗糖酶在3個土壤樣品間差異顯著，柴胡根際土中的脲酶活性最高，為6.54 mg·(g·24 h)-1，而蔗糖酶活性最低，為8.64 mg·(g·24 h)-1；黨參根際土中脲酶活性最低，為0.55 mg·(g·24 h)-1，蔗糖酶活性最高為11.40 mg·(g·24 h)-1。

圖1 遠志、柴胡、黨參植物根際土壤環境因子Fig. 1 Edaphic factors of rhizosphere of P. tenuifolia, B. Chinense and C. pilosula

2.2 細菌群落組成及多樣性

在97%的相似度水平下，鑒定得到了3種植物土壤樣品中細菌的OTU個數，對OTU代表序列進行聚類和物種注釋，共檢測出細菌有 27個門、80個綱、127個目、215個科、296個屬和223個種，可見，該區植物根際細菌群落具有較高的多樣性。其中，土壤優勢細菌門組成如圖2所示，包括變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes）和Saccharibacteria門。在3種植物根際土中，變形菌門均為第一優勢類群，其相對豐度在遠志、黨參、柴胡根際土中分別達到32.37%、37.61%和30.64%。酸桿菌門在柴胡根際相對豐度最大，為26.43%。放線菌門在遠志根際相對豐度最大，為27.17%；在黨參根際相對豐度最小10.67%。硝化螺旋菌在黨參根際較多，而酸桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門等在 3種植物根際差異不大。

圖2 門水平上的細菌組成Fig. 2 Classification of bacterial sequencing at level of phylum

表1 3種藥材根際土壤細菌群落多樣性Table 1 Diversity of bacteria communities of three species rhizosphere

3種藥材植物根際土壤細菌群落α多樣性分析結果見表1。其中黨參根際細菌群落 Shannon指數最大（6.174），Simpson指數最小（0.004），可見黨參根際細菌群落多樣性最高，而均勻度較低。遠志的 Shannon指數最小（6.079），Simpson指數最大（0.006），說明遠志根際細菌群落的多樣性較低，而均勻度較高。柴胡的ACE指數和Chao1指數最大，表明其根際細菌群落中種類數目最多；黨參根際細菌群落的ACE和Chao1指數最低。

2.3 環境因子對土壤細菌群落的影響

在不同的生境中，影響微生物群落結構和多樣性的環境因子有一定的差異。本研究利用Spearman方法分析了土壤環境因子和根際細菌α多樣性指數的相關性（表2），結果表明根際土壤含水率與細菌群落Shannon指數呈顯著正相關，pH與Simpson指數呈顯著負相關，TN與ACE指數呈正相關，脲酶活性與ACE指數呈顯著正相關、與Coverage指數呈正相關，蔗糖酶活性與Coverage指數呈負相關，過氧化氫酶活性與Chao1指數、Simpson指數呈正相關。

運用Spearman分析和RDA進一步篩選細菌群落構建的主要驅動因子，由圖3可見，土壤總氮、脲酶活性與硝化螺旋菌門的豐度呈顯著負相關；總碳、過氧化氫酶活性、總氮與綠彎菌門的豐度呈負相關；pH與硝化螺旋菌門、浮霉菌門的豐度呈正相關；過氧化氫酶與芽單胞菌門的豐度呈顯著負相關，總硫、亞硝態氮與根際土壤優勢菌門的豐度相關性不顯著。RDA1和RDA2兩軸共解釋了59.2%的變異率，通過前選擇篩選出影響微生物群落的環境因子是pH、總氮、脲酶活性、過氧化氫酶活性和蔗糖酶活性（圖4）。

表2 環境因子與多樣性指數的Spearman相關分析Table 2 Spearman correlation analysis of environmental factors and diversity index

圖3 前10門細菌與環境因子相關分析Fig. 3 Correlation analysis between the top 10 bacteria and environmental factors

2.4 細菌群落結構驅動因素分析

利用方差分解分析土壤環境因子與植物對土壤細菌群落結構的影響作用（圖5），結果表明，土壤因子、植物單獨對細菌群落結構動態影響的解釋分別為 0.02、0.08，土壤因子與植被類型共同解釋部分為0.60。由此可見，土壤環境因子與植物的交互作用對細菌群落結構動態具有重要作用。

利用Tucker et al.（2016）提出的零模型中零偏差值的大小來區分群落構建過程中受確定性過程和隨機性過程的相對大小。零偏差值大，受確定性過程較大；零偏差值小，受隨機過程較大。本研究結果中零偏差值均大于0（圖6），表明研究區土壤細菌群落構建的驅動因素中確定性過程占主導作用。

圖4 細菌群落（OTU水平）與環境因子的冗余分析Fig. 4 Redundancy analysis（RDA）of bacterial community(OTU level) and environmental factors

圖5 方差分解分析土壤環境因子和植物類型對真菌群落影響相對大小Fig. 5 Variation partitioning analysis showing the percentages of variance in bacteria communities explained by soil environmentfactor and medicine plant type

圖6 細菌群落在不同樣地的零模型Fig. 6 Null model of the bacteria community across the plots

3 討論

微生物作為地球物質化學循環的主要驅動者，在植物-土壤系統中發揮重要作用。環境因子通過影響微生物群落的結構和多樣性，進而影響微生物群落在環境中的功能，反過來，微生物群落對土壤環境因子產生重要影響，二者相互作用，驅動了植物-土壤系統的健康運行。本研究中，3種植物根際土壤理化性質的差異主要表現在土壤酸堿度、脲酶、蔗糖酶、總碳和總硫，主要是由于這些因子受植物根際的影響更為明顯，如根系分泌物對土壤酸堿性、土壤酶和總碳具有重要的影響（Bais et al.，2006），導致這些因子在不同植物根際土壤中的差異性。

3種藥材根際土壤優勢細菌類群主要有變形菌門（30.64%—37.61%）、放線菌門（10.67%—27.17%）、擬桿菌門（4.72%—6.70%），多為參與分解有機質的類群。本研究發現由這些細菌類群為優勢類群形成的根際土壤微生物群落結構與土壤的pH、總氮、脲酶、過氧化氫酶、蔗糖酶具有顯著的相關性，說明植物根際土壤環境因子對細菌群落結構具有重要的影響（Lauber et al.，2009；喬沙沙等，2017）。這些因子對根際真菌群落的結構也具有重要的影響（李毳等，2019）。Siles et al.（2016）的研究發現，土壤pH與土壤細菌豐富度無顯著相關性，但是與細菌群落的物種多樣性顯著相關。土壤酶是由微生物或植物根系分泌產生的胞外酶，用于水解或氧化降解土壤中相應的有機物，其活性與土壤性質、土壤類型等環境條件密切相關，其中脲酶、過氧化氫酶對環境變化更為敏感（Liang et al.，2003；Nottingham et al.，2016；Liu et al.，2017）。土壤細菌群落的豐富度指數與土壤脲酶活性顯著正相關，均勻度指數與土壤蔗糖酶活性顯著正相關（馬轉轉等，2018）。土壤含水率對細菌群落組成也具有顯著影響（Menezes et al.，2016），本研究土壤含水率與細菌Shannon指數呈顯著正相關。氮是微生物代謝必需的元素，對微生物的生長具有重要的影響，但不同的微生物類群對氮的響應有一定的差異。Ramirez et al.（2012）對28個不同生態環境的土壤添加無機氮，發現施氮可以顯著增加放線菌的相對豐度，但降低了酸桿菌的相對豐度。本研究中的土壤總氮與放線菌的豐度呈正相關，與酸桿菌的豐度呈負相關，說明不同細菌類群對氮的響應不同。

植物對其根際微生物群落的“選擇”主要是通過根系分泌物來實現的（Singh et al.，2004）。根際環境中，細菌群落對各種根分泌物的利用率和敏感性遠遠超過放線菌、真菌、藻類和原生動物等，它們在根際微生物中最為活躍并占主導地位，與植物根系共生共存。植物根際分泌物中豐富的糖類、氨基酸及維生素等對土壤微生物的種類、數量及分布具有顯著的影響（Chaudhary et al.，2016）。本研究認為，植物類型是根際土壤細菌群落結構和多樣性的主要驅動因子之一。但是，關于植物種對其根際微生物群落結構驅動作用，尚無一致的觀點。Nunan et al.（2005）利用DGGE方法研究草地根際土壤細菌群落與植物種的關系時，發現植物種對于細菌群落的影響遠遠小于土壤環境因子。也有一些研究表明植物對土壤微生物群落結構的作用大于土壤理化因子（Germida et al.，1998）。植物種和土壤環境因子對土壤微生物群落結構影響程度可能是由于它們作用的相對“強度”不同，同時也與土壤微生物的特性有關，r-型菌易受環境條件的影響，變化較大，k-型菌則變化不明顯（王光華等，2006）。

植物-土壤-微生物的相互作用是維持物種多樣性的重要驅動力（Reynolds et al.，2003）。本研究中土壤環境因子和植物類型的交互作用共同解釋了 3種藥用植物根際土壤微生物群落構建的 60%。Tucker et al.（2016）指出，零模型的零偏差值可以代表群落的相似性比期望值更加相似（負值），或更加相異（正值）。由于零模型是分析觀測值相似性偏離期望值相似性的程度（(βobs-βnull)/βnull）。本研究結果中的零偏差值在各個樣地都是正值，進一步說明土壤環境因子是植物根際細菌群落構建的主要驅動因子。

總之，3種藥用植物根際土壤理化性質具有顯著差異，植物根際分泌物可能是造成這種差異的主要原因。根際土壤酸堿度、脲酶、蔗糖酶、總碳和總硫差異導致根際細菌群落結構和多樣性的顯著差異，而細菌群落的差異對土壤營養的有效性產生影響，最終，形成特定的植物-土壤-微生物系統，為道地藥材植物的生長提供了適宜的生境。