精子-固相透明質酸分離法選擇精子的整體質量分析*>

董波 姚曉飛 方東 宋焱鑫

（河南省洛陽市婦幼保健院男科醫學研究所 洛陽471000）

近年來，由于環境污染以及人們生活水平和生活方式的改變，不孕不育已經成為社會關注的焦點問題。目前治療不孕不育的有效手段為輔助生殖技術（Assisted Reproductive Techniques,ART），傳統的輔助生殖技術包括宮腔內人工授精（Intrauterine Insemination, IUI）、 經 陰 道 授 精（Intravaginal Insemination, IVI） 和單精子卵胞漿顯微注射（Intracytoplasmic Sperm Injection,ICSI）技術[1]。ICSI技術主要治療由男性因素引起的不孕不育，可將單個精子直接注射入卵母細胞內，避開了正常受精時對異常精子的淘汰和篩選過程，因此，ICSI 精子的體外篩選尤為重要[2～3]。固相透明質酸-單精子選擇法是利用能夠與透明質酸（Hyaluronic Acid,HA）結合的精子具有較好的發育成熟度、基因完整性高的原理，從而改善精子對受精胚胎的信息傳遞[4]。本研究旨在分析精子-固相透明質酸分離法選擇精子的整體質量。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年9月～2018年12月于我院生殖醫學研究所實施單精子卵胞漿內顯微注射輔助生殖技術的44例男性患者為研究對象，采用隨機數字表法分為研究組和常規組各22例。研究組年齡28～58 歲，平均年齡（38.18±8.38）歲；不育年限1～11年，平均年限（5.09±3.13）年；原發不孕8例，繼發不孕14例；精液量（3.45±1.20）ml；pH 值（7.23±0.12）。常規組年齡29～57 歲，平均年齡（37.95±7.98）歲；不育年限1～10年，平均年限（5.31±2.58）年；原發不孕7例，繼發不孕15例；精液量（3.26±1.25）ml，pH 值（7.21±0.15）。兩組患者一般資料（年齡、不孕不育年限、精液量和pH 值等）比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 入組標準 納入標準：（1）臨床資料完整者；（2）符合國際衛生組織（WHO）制定的不孕不育診斷標準者；（3）簽署患者知情同意書；（4）研究經醫院醫學倫理委員會批準同意者。排除標準：（1）合并心肺、腎臟功能嚴重障礙患者；（2）具有精神障礙或依從性不高患者；（3）具有血液性疾病患者；（4）具有嚴重家族性遺傳疾病患者。

1.3 研究方法 兩組患者取精液后，精液在室溫下自然液化，室溫下行計算機輔助精液分析。常規組患者采用密度梯度法選擇精子，取80%PureSperm液1 ml 加入15 ml 錐形離心管底，再加入40%PureSperm 液1 ml，兩者之間界面清晰，在上層加入0.5 ml 精液，300×g離心20 min，吸除上層介質和精漿，吸取試管底部精子轉移至新錐形離心管。精子團塊以1.5 ml 培養液懸浮，500×g離心10 min，去上清液，兩次后精子團塊加培養液至0.5 ml，混勻后行計算機輔助精液分析。研究組患者采用精子-固相透明質酸分離法，首先將HA-ICSI 裝置從2～8℃冰箱取出，平衡室溫后使用密度梯度電泳法分離并洗滌精子，以含有4 mg/ml 人白蛋白的培養液調節精子至0.5×106/ml 待用，準備培養液液滴、聚烯吡酮（PVP）液滴，吸取25 μl 分離后的精子至HA-ICSI裝置中央小槽內，使精子懸液盡可能布滿，覆蓋礦物油。裝置加蓋，在ICSI 顯微鏡熱臺反應1～10 min，挑選被透明質酸結合的成熟精子。吸取被透明質酸結合的精子至PVP 液滴制動，在PVP 液滴的不同區域洗滌精子，選擇形態最好的精子進行傳統的ICSI操作。

1.4 觀察指標 比較兩組精子質量參數指標：精子正常形態率、獲能2 h 酪氨酸磷酸化（TP）、△TP（精子獲能2 h TP 率-未獲能精子TP 率）、誘發頂體反應（AR）和△AR（誘發AR 率-自發AR 率）；比較兩組精子成熟障礙指標：自發AR、核蛋白不成熟度和DNA 碎片率；比較兩組精子運動參數：精子活動率、精子向前運動率、軌跡速度（VCL）、向前運動速度（VSL）、精子運動路徑速度（VAP）、線速度（LIN）、精子頭擺幅度（ALH）、擺動頻率（BCF）。

1.5 統計學方法 對數據收集的資料進行整理并使用統計學軟件SPSS22.0 進行處理，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，計數資料用率表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組精子質量參數指標比較 研究組精子正常形態率、獲能2 h TP、△TP、誘發AR 和△AR 高于對照組（P＜0.01）。見表1。

表1 兩組精子質量參數指標比較（%，±s）

注：與常規組比較，*>P＜0.01。

組別 n 精子正常形態率 TP △TP 誘發AR △AR研究組常規組22221.85±0.34*>1.25±0.154.61±1.54*>3.25±1.042.15±0.57*>1.06±0.226.04±1.34*>4.67±1.283.24±0.87*>2.62±0.34

2.2 兩組精子成熟障礙指標比較 研究組自發AR、核蛋白不成熟度和DNA 碎片率顯著低于對照組（P＜0.01）。見表2。

表2 兩組精子成熟障礙指標比較（%，±s）

表2 兩組精子成熟障礙指標比較（%，±s）

注：與常規組比較，*>P＜0.01。

組別 n 自發AR 核蛋白不成熟度 DNA 碎片率研究組常規組222226.64±12.34*>43.48±15.6428.64±12.31*>52.54±15.6716.25±8.49*>32.64±9.64

2.3 兩組精子運動參數比較 研究組LIN 顯著高于常規組（P＜0.05）；兩組精子活動率、精子向前運動率、VCL、VSL、VAP、ALH 及BCF 比較無顯著性差異（P＞0.05）。見表3。

表3 兩組精子運動參數比較（±s）

表3 兩組精子運動參數比較（±s）

注：與常規組比較，*>P＜0.05。

組別 n 精子活動率（%） 精子向前運動率（%） VCL（μm/s） VSL（μm/s） VAP（μm/s） LIN（%） ALH（μm） BCF（Hg）研究組常規組222278.26±6.5879.21±4.2672.15±7.6168.64±6.2852.16±5.9449.28±5.1434.25±4.2933.58±5.2440.21±4.6538.64±5.0775.37±5.41*>67.25±4.513.59±0.343.48±0.4119.64±2.6418.64±1.25

3 討論

據統計，我國不孕不育患者呈現高增長狀態，不孕不育癥的發生率占育齡夫婦的15%以上[5]。目前臨床上常使用ICSI 治療不孕不育。傳統的ICSI 挑選精子的方法首先是上游法或密度梯度法將精子提純，然后使用顯微鏡評估精子活躍度和形態，挑選精子進行注射，但是由于儀器的限制，在挑選過程中難以避免胞核異常和胞質發育不良的精子[6]。因此，建立一種方便有效的篩選方法尤為重要。

密度梯度離心法是根據正常精子與不活動精子，畸形精子及精液中的其他細胞成分在密度梯度溶液柱中的運行能力、浮力密度和運動軌跡等方面存在著差異，從而達到分離正常精子的目的。但是該方法對優質精子的選擇能力依然有限，精子-固相透明質酸分離法是一項具有此潛質的精子處理新技術[7]。受精過程中，精子與卵母細胞相互作用之前，精子需要獲能，TP 發生在精子獲能期間，有關研究發現，獲能精子尾部的TP 程度與精子-卵細胞透明袋的結合能力有關[8]。在精子獲能后，頂體膨大，精子外膜融合脫落，發生AR，頂體內儲存的與受精有關的酶釋放，參與精子和卵子的受精過程[9]。本研究中，研究組較常規組正常形態率、獲能2 hTP、△TP、誘發AR 和△AR 明顯增高，而自發AR、核蛋白不成熟度和DNA 碎片率顯著降低。這是由于透明質酸是人卵母細胞和透明帶黏液基質的主要成分，精子在成熟的后期可獲得與透明質酸特異性結合的能力，并且精子可產生特異的與透明質酸結合的蛋白位點，使精子能夠與卵母胞透明帶結合，從而實現穿透與受精[10]。有研究顯示，精子-固相透明質酸法分離后精子的運動能力并不遜于密度梯度法，且前者的正常形態精子比例更高，能夠與透明質酸結合的精子，其DNA 損傷率、核蛋白苯胺藍著色率明顯低于同一原始精液標本[11]。研究組LIN 顯著高于常規組（P＜0.05）；兩組精子活動率、精子向前運動率、VCL、VSL、VAP、ALH 及BCF 比較無顯著性差異（P＞0.05），與上述研究結果相似。

綜上所述，基于成熟精子頭部具有透明質酸受體可與外源性透明質酸特異性結合原理的精子-固相透明質酸分離技術，與傳統的密度梯度法相比，分離后的精子具有更優的受精潛能和成熟度，可顯著提高分離精子的整體質量，有望進一步改善輔助生殖結局。