MIF 在誘導類風濕關節炎滑膜增殖中的作用及機制研究*>

余淑嬌 吳銳

（南昌大學第一附屬醫院風濕免疫科 江西南昌330006）

類風濕關節炎（RA）是一種病因未明的慢性疾病，臨床上以延續滑膜炎為主，其特征為手、足小關節的多關節、對稱性及侵襲性關節炎癥，隨著病情的不斷發展引起關節畸形、功能喪失，影響患者健康、生活[1]。RA 病因復雜，普遍認為與遺傳、感染及性激素等有關，且患者發病后常伴有細胞增生、間質大量炎性細胞浸潤及微血管新生、骨組織破壞等，具有類似于“局部惡性腫瘤”的增生性與破壞性特點[2]。既往研究表明：巨噬細胞移動抑制因子（MIF）在RA患者滑膜炎癥中發揮了重要作用，屬于一種內分泌免疫物質，能限制體內巨噬細胞活動[3]。本研究以關節置換術的RA 患者作為對象，探討MIF 在誘導類風濕關節炎滑膜增殖中的作用及機制。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2018年3月～2019年6月行關節置換術的RA 患者46例作為對象。其中男25例，女21例；年齡44～65 歲，平均（57.56±5.66）歲；病程11～25年，平均（19.43±4.31）年。

1.2 儀器與設備 見表1。

表1 儀器與設備

1.3 納入與排除標準 納入標準：（1）符合RA 診斷標準，均經臨床確診[4]；（2）均擬行關節置換術治療，且可耐受手術；（3）能與家屬和（或）醫師進行交流。排除標準：（1）合并惡性腫瘤、器質性疾病或血液系統疾病者；（2）合并精神異常、認知功能障礙或肝腎異常者。

1.4 檢測方法

1.4.1 MIF 表達水平測定 （1）RNA 的分離、提取。手術過程中取RA 患者滑膜組織及正常組織（距病灶超過2 cm 的組織），向標本中加入Trizol 500 μl，充分混合后轉移到1.0 ml 離心管，振蕩5 min 后靜置。向不同組織中加入氯仿200 μl 振蕩15 s，靜置5 min 后離心15 min，離心力12166×g。去除上層清液，加入預冷的乙醇（濃度75.0%）1 ml，常溫下干燥7 min，經紫外分光度儀A260 下測定吸光度值。（2）檢測方法。采用實時熒光PCR 技術測定不同組織中MIF 表達水平，引物見表2[5]。PCR 參數：30℃下10 min；42℃下30 min；99℃下5 min；5℃下5 min，連續進行35 個循環，72℃下10 min 延長，獲得最終產物并放入1.5%瓊脂凝膠電泳，β-actin 為內對照。

表2 MIF 引物設計

1.4.2 siMIF 轉染滑膜細胞 取滑膜細胞原代培養，并連續完成72 h 轉染siMIF，利用轉染試劑盒（R0510）操作說明書完成細胞的轉染。應用1×riboFECTTM CP Buffer 稀釋siRNA，充分混合后加入3 μl riboFECTTM CP Reagent，完成轉染復合物的制備。常溫下完成10 min 孵育，將轉染復合物加入適量的無雙抗完全培養基中，充分混合均勻后放置在37℃孵育箱中連續進行24～72 h 培養[6]。

1.4.3 細胞活性及細胞凋亡測定 （1）細胞活性測定。采用CCK8 法完成細胞活性測定，取未轉染、轉染后對細胞，調整細胞濃度為1×105/ml，接種在96孔板輸尿管，每孔100 μl，連續進行24～72 h 培養，然后向每孔中加入CCK810 μl，孵育箱中連續進行2 h 培養，450 nm 酶標儀下完成吸光度值測定[7]。（2）細胞凋亡測定。采用流式細胞儀完成不同細胞凋亡測定。取轉染后及未轉染的細胞，將培養液吸出到15 ml 離心管中，采用PBS 完成1 次沖洗，加用濃度為0.25%胰酶進行消化2 min，然后向細胞中加入終止培養液終止培養。輕輕吹下細胞，并將其轉移到15 ml 離心管中進行離心5 min，速度1000 rpm，去除上層清液后加入PBS，調整細胞數為1×106/ml，取細胞懸液1 ml，離心5 min，離心速度1000 rpm，去除上清并向細胞中加入Annexin V-TDTC 5 μl，并加入PI 10 μl，充分混合后避光孵育10 min。上述操作完畢后采用流式細胞儀進行檢測[8]。

1.5 觀察指標 （1）RA 患者正常組織與滑膜組織中MIF RNA 表達水平；（2）轉染MIF 與未轉染MIF細胞活性、凋亡率。

1.6 統計學分析 采用SPSS18.0 統計學軟件處理數據。計數資料用%表示，行χ2檢驗；計量資料用（±s）表示，行t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中MIF RNA 表達水平比較 RA 滑膜組織中MIF RNA 表達水平高于正常組織（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同組織中MIF RNA 表達水平比較

2.2 不同細胞活性比較 轉染MIF 與未轉染MIF細胞均完成72 h 培養，隨著培養時間的延長細胞增殖速度增加，轉染MIF 細胞24 h、48 h 及72 h 細胞增殖率均高于未轉染MIF 細胞（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同細胞活性比較

2.3 不同細胞凋亡率比較 轉染MIF 與未轉染MIF 細胞培養24 h、36 h 細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；轉染MIF 細胞培養48 h、72 h細胞凋亡率均低于未轉染MIF 細胞（P＜0.05）。見表3。

表3 不同細胞凋亡率比較（%，±s）

表3 不同細胞凋亡率比較（%，±s）

細胞類型 24 h 36 h 48 h 72 h轉染MIF非轉染MIF tP 36.39±4.5335.88±4.521.2130.63743.73±5.0942.49±5.030.8910.66258.78±6.7375.93±7.817.4510.00065.02±7.8280.48±7.895.3980.000

3 討論

RA 是臨床常見疾病，病理改變以滑膜炎、滑膜組織增生為主?；ぜ毎ɑこ衫w維細胞、滑膜巨噬細胞，而滑膜成纖維細胞在滑膜細胞增殖、遷移及促炎中發揮了重要的作用。MIF 在人體中較為重要，是一種內分泌免疫物質，能限制體內巨噬細胞的活動。臨床研究[9]表明，當身體某個器官發生不正常的細胞活動后，會將信號反饋到內分泌-免疫網絡，從而產生移動因子，并作用在巨噬細胞上，能促進巨噬細胞快速移動到不正常細胞的活動區域進行吞噬。當該吞噬行為達到一定程度后，內分泌-免疫網絡將會接受到反饋信號，限制巨噬細胞過量吞噬。

本研究中，RA 滑膜組織中MIF RNA 表達水平高于正常組織（P＜0.05）；轉染MIF 與未轉染MIF細胞均完成72 h 培養，隨著培養時間的延長細胞增殖速度增加，轉染MIF 細胞24 h、48 h 及72 h 增殖率均高于未轉染MIF 細胞（P＜0.05），說明MIF 在RA 患者中呈高表達，能促進細胞的增殖。為了進一步分析MIF 在類風濕關節炎細胞中的作用，本研究中將MIF 轉染到類風濕關節炎細胞中，完成細胞凋亡測定，結果轉染MIF 與未轉染MIF 細胞培養24 h、36 h 細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；轉染MIF 細胞培養48 h、72 h 細胞凋亡率均低于未轉染MIF 細胞（P＜0.05），說明MIF 能抑制類風濕關節炎滑膜細胞凋亡。因此，臨床上積極采取有效的措施抑制MIF 能延緩病情進展，有望實現對RA 的有效治療[10]。綜上所述，MIF 在類風濕關節炎組織中呈高表達，能促進類風濕關節炎滑膜細胞的增殖，抑制其凋亡，從而參與滑膜增生。