三聚氰胺與牛血清白蛋白相互作用的光譜學研究

楊美玲，崔東亞，牛潤華

（運城學院應用化學系，山西 運城 044000）

三聚氰胺［Melamine，C3N3（NH2）3］又名蛋白精，其化學結構見圖1。在溶液中呈弱堿性，與三大強酸均能形成三聚氰胺鹽，是一種常用的化工產品［1-3］。三聚氰胺具有低毒性，長期服用會導致腎結石和膀胱結石，尤其對免疫力較低的嬰幼兒，傷害更大［4，5］。在美國，三聚氰胺作為飼料非法添加劑已被明令禁止使用，主要原因是在2007年曾誘發了當地大量的寵物死亡。目前，對三聚氰胺與血清白蛋白相互作用探討的文獻很少，本試驗主要研究了在接近生理條件的基礎上，以三聚氰胺和體內血液中蛋白含量較高的血清白蛋白作為作用原型，利用熒光光譜和紫外-可見吸收光譜作為研究工具，研究三聚氰胺與BSA相互作用的熒光猝滅效果和熱力學特征，求算其相互作用的相關作用常數和熱力學參數，分析兩者相互作用的機制，為三聚氰胺中毒的臨床病癥以及藥代動力學的深入研究提供有價值的信息。

圖1 三聚氰胺的分子結構

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外分光光度計（美國Agilent公司，Agilent-8453型）；熒光分光光度計（美國PE公司，LS-55型）；圓二色譜儀（日本Jasco公司，J-810型）；恒溫水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司）。

三聚氰胺三（羥甲基）胺基甲烷（Tris）、濃鹽酸等均為分析純；牛血清白蛋白（BSA）購于國藥集團化學試劑有限公司；BSA和三聚氰胺溶液均以pH 7.40、濃度0.01 mol/L的Tris-HCl緩沖液（內含維持離子強度50 mmol/L NaCl溶液）為溶劑配制而成，儲備液放入冰箱中待用。試驗用水為二次去離子蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 紫外光譜法 在室溫下，以Tris-HCl（pH=7.40）緩沖溶液為參比，在300～450 nm內掃描2.00×10-3mol/L三聚氰胺的紫外吸收光譜。

1.2.2 熒光光譜法 在不同溫度下，以280 nm為激發波長，掃描三聚氰胺溶液（2.00×10-3mol/L）滴定10.0 mL 3.0×10-6mol/L牛血清白蛋白溶液得熒光發射光譜。

1.2.3 圓二色譜法 以Tris-HCl（pH 7.40）緩沖溶液為參比，在室溫下，用濃度為2.00×10-3mol/L的三聚氰胺溶液滴定10 mL 3.00×10-6mol/L的BSA溶液，掃描其190～250 nm的圓二色譜。

2 結果與分析

2.1 紫外-可見光譜分析

圖2為三聚氰胺與BSA相互作用的紫外-可見吸收光譜。由圖2可知，BSA最大吸收峰在280 nm處，隨著三聚氰胺濃度不斷增大，BSA吸收強度不斷增強，而三聚氰胺在這一范圍內沒有紫外吸收，說明BSA紫外吸收強度的變化是由于三聚氰胺的加入而引起的，故此可初步判定三聚氰胺和BSA發生了相互作用，形成了一種新的復合物。

圖2 三聚氰胺與BSA紫外吸收光譜

2.2 熒光光譜

圖3 是不同溫度下三聚氰胺與BSA相互作用的熒光光譜，圖3中曲線1～9（按照最高熒光強度的峰值由高到低排列）分別代表nBSA∶nMelamine=1∶0，1∶1，1∶2，1∶3，1∶6，1∶9，1∶12，1∶15，1∶18體系。由圖3可知，BSA的熒光強度隨著三聚氰胺濃度的增大而逐漸減小，而三聚氰胺在300～500 nm基本沒有熒光，進一步說明三聚氰胺與BSA之間可發生相互作用形成了新的復合物致使BSA的熒光發生猝滅。

圖3 三聚氰胺與BSA的熒光光譜

2.3 熒光猝滅機理

2.3.1 猝滅常數 熒光分子和小分子藥物之間相互作用致使熒光物質的熒光強度有所減弱的物理或化學過程稱為熒光猝滅或熒光熄滅。熒光猝滅一般可分為靜態猝滅和動態猝滅兩種。熒光分子和小分子藥物之間由于發生碰撞引起熒光強度減弱的是動態猝滅，在這一過程中體系溫度升高，擴散系數增大，因此在動態猝滅過程中猝滅常數也會伴隨著溫度的升高而逐漸增大，但卻不會影響到熒光物質的分子結構。而靜態猝滅則是熒光分子在基態時就與小分子藥物相互作用，從而形成不發熒光的或是熒光很弱的一種新型復合物，從而使得熒光物質的熒光強度逐漸減弱，產生猝滅。但是由于復合物的穩定性會隨著溫度的升高而減弱，因此在靜態猝滅過程中，猝滅常數會隨著溫度的升高而減小。

通常動態猝滅過程遵循Stern-Volmer方程［6，7］：

式中，Q為三聚氰胺濃度（mol/L）；Kq為三聚氰胺對BSA猝滅過程中的雙分子猝滅速率常數（L/mol·s）；τ0為猝滅劑不存在時熒光 體生物大分子的壽命，為10-8s［8］；F0為沒有加入三聚氰胺時BSA的熒光強度；F為加入三聚氰胺后BSA的熒光強度。以Q作為橫坐標，F0/F作縱坐標繪制Stern-Volmer曲線，所得曲線斜率即為KSV，如圖4所示，若將體系視為動態猝滅，則可通過K SV求得雙分子猝滅速率常數K q，具體計算數據見表1。

表1 不同溫度下三聚氰胺與BSA相互作用的猝滅常數

一般動態猝滅常數會隨著溫度的升高而不斷增大，但從圖4和表1可以看出，在不同溫度下，三聚氰胺對BSA的熒光動態猝滅常數K S V隨著溫度的升高變化不大，而雙分子猝滅速率常數Kq卻比小分子藥物猝滅劑對蛋白質的最大擴散猝滅常數2.0×1010L/mol·s大的多。由此可推斷出三聚氰胺對BSA的熒光猝滅不是由于分子碰撞所引起的動態猝滅，而應是由三聚氰胺和BSA二者之間相互作用形成了新的復合物所引起的靜態猝滅。

圖4 三聚氰胺與BSA相互作用的Stern-Volme曲線

2.3.2 結合常數和結合位點數 在靜態猝滅過程中，三聚氰胺分子會在蛋白質分子上n1個相同且獨立位置上與其結合，且其結合常數、結合位點數及其對熒光猝滅劑的用量均符合Lineweaver-Burk方程［9］。

式中，KA和n1分別表示兩者的結合常數和結合位點數。以lg(F0/F-1)對lgQ作圖，可得圖5，依據斜率和截距可以求算出三聚氰胺與BSA相互作用的結合常數KA和結合位點數n1，具體計算數據見表2。由表2可知，三聚氰胺與BSA的結合位點數n1約為1，即1個三聚氰胺藥物分子會與1個BSA上的某個位點處結合；而結合常數KA均大于103，說明三聚氰胺與BSA之間的作用力較強。

表2 不同溫度下三聚氰胺與BSA的結合常數及結合位點數

圖5 三聚氰胺與BSA相互作用的Lineweaver-Burk曲線

2.3.3 作用力類型的確定 Ross等［10］總結了蛋白質與小分子性質結合存在的熱力學規律如下：若ΔH＞0、ΔS＞0，為疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＞0，為靜電作用力；ΔH＜0、ΔS＜0，可以是氫鍵結合或通過范德華力結合。當溫度上升幅度較小時，反應的標準焓ΔH可以看作常數，根據Gibbs—Helmholtz熱力學方程［11，12］式（3）至式（5）分別求得ΔH、ΔS、ΔG，其計算結果見表3。三聚氰胺與BSA結合的焓變ΔH＞0、熵變ΔS＞0，所以兩者之間主要依靠疏水作用力相結合。

表3 三聚氰胺與BSA在不同溫度下相互作用的熱力學參數

2.3.4 結合距離的計算 按照F?rster能量轉移原理，若熒光體的熒光發射光譜和猝滅劑的紫外吸收光譜有重疊部分，且兩者之間的結合距離不超過7 nm，則熒光體發生熒光猝滅的主要原因之一是非輻射能量的轉移。

圖6是三聚氰胺與BSA的熒光光譜和紫外吸收光譜的重疊情況。猝滅劑三聚氰胺和BSA的結合距離r0和它們之間的能量轉移效率E及臨界能量轉移距離R0之間的關系遵循式（6）［12，13］。

圖6 BSA的熒光光譜和三聚氰胺的紫外光譜的重疊

式中，F為BSA和三聚氰胺濃度為1∶1時溶液的熒光強度。

R0與三聚氰胺的熒光量子產率φ、偶極空間取向因子k2以及介質折射指數存在式（7）關系。

式中，k2=2/3，φ=0.118，N=1.336，J為BSA熒光光譜與三聚氰胺吸收光譜的重疊積分。

2.4 圓二色譜法

圓二色譜法是一種簡單、快速、靈敏的研究稀溶液中蛋白質構象的光譜技術。圖7給出了不同濃度的三聚氰胺對牛血清白蛋白影響的CD光譜。圖7中1曲線為BSA空白，分別在208 nm和222 nm處出現了2個負峰，而隨著三聚氰胺濃度的不斷增大，BSA的CD光譜的振幅相應明顯減弱，說明三聚氰胺與BSA結合后使得BSA的內源熒光減弱，BSA的肽鏈伸展，α-螺旋減少，二級結構發生了顯著的變化［14］。

圖7 三聚氰胺與BSA相互作用的CD光譜

3 結論

三聚氰胺對牛血清白蛋白的熒光猝滅機理為靜態猝滅，二者之間的相互作用力主要為疏水作用力，結合距離為3.7 nm，小于7.0 nm，因此三聚氰胺能使牛血清白蛋白的熒光發生猝滅的主要原因為非輻射能量轉移。圓二色譜測試結果表明，三聚氰胺能較大程度地改變牛血清白蛋白的二級結構，因此對牛血清白蛋白具有較強的毒副作用。