UPLC-MS/MS測(cè)定小麥中八種除草劑和真菌毒素

趙 健，陳 國(guó)，章 豪，吳銀良

（寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040）

小麥?zhǔn)侵袊?guó)主要農(nóng)作物之一，在其生長(zhǎng)過程中，使用除草劑防治雜草是提升小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的重要手段［1］，但除草劑不科學(xué)使用或?yàn)E用，會(huì)對(duì)小麥造成污染。小麥在生長(zhǎng)過程被真菌感染，在生長(zhǎng)過程和儲(chǔ)存過程中不斷產(chǎn)生真菌毒素，并通過餐桌被人或動(dòng)物攝入，產(chǎn)生毒害［2，3］。因此，對(duì)小麥除草劑和真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)保證人們的健康具有積極的意義。目前，除草劑和真菌毒素檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外已有報(bào) 道，檢 測(cè) 儀 器 多 為 氣 相 色 譜 儀［4，5］、液 相 色 譜儀［6，7］、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀［8，9］、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀［10，11］和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀［12-15］等，但現(xiàn)有的檢測(cè)方法仍以單獨(dú)的除草劑或真菌毒素為主，同時(shí)測(cè)定小麥中除草劑和真菌毒素的方法仍較少。本研究基于現(xiàn)有研究，開發(fā)出一種同時(shí)測(cè)定小麥中8種藥物（異丙隆、二甲四氯、苯磺隆、芐嘧磺隆、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、雜色曲霉毒素、T-2）的方法，旨在為糧谷樣品快速檢測(cè)除草劑和真菌毒素提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 儀器

XEVO TQ MS超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，配ESI，美國(guó)Waters公司；model 9860超聲波清洗器，天津科貝兒光電技術(shù)有限公司；氮吹儀，美國(guó)Organomation公司；PL3002電子天平、XPE205電子天平，Mettler Toledo；離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司；KS4000ic控溫?fù)u床，德國(guó)IKA公司；勻漿儀，德國(guó)IKA公司；LM3310實(shí)驗(yàn)?zāi)ィ鸬銹erten公司。

1.2 試劑

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；石墨化碳、N-丙基乙二胺、硅膠，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；異丙隆、二甲四氯、苯磺隆、芐嘧磺隆為德國(guó)Dr.Ehrenstorfer；伏馬毒素B1、雜色曲霉毒素、伏馬毒素B2、T-2為加拿大TRC，純度均大于95%。小麥樣品粉碎，儲(chǔ)存于-20℃。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱取異丙隆、二甲四氯、苯磺隆、芐嘧磺隆、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、雜色曲霉毒素、T-2藥物固體標(biāo)樣，乙腈溶解配制100 mg/L儲(chǔ)備液，-20℃保存。再移取各儲(chǔ)備液配制成2 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 提取溶液的配制 準(zhǔn)確量取850 mL乙腈、140 mL超純水和10 mL甲酸，混合均勻，配制成乙腈-水-甲酸混合溶液。

1.3.3 樣品提取與凈化 準(zhǔn)確稱取小麥空白樣品5.00 g于50 mL塑料離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL乙腈-水-甲酸混合溶液，勻漿儀上10 000 r/min勻漿2 min，振蕩10 min后超聲2 min，離心5 min（9 000 r/min）。準(zhǔn)確移取5.00 mL上清液至裝有30 mg石墨化碳的10 mL塑料離心管中，渦旋振蕩1 min后，離心3 min（9 000 r/min），準(zhǔn)確移取4.00 mL凈化溶液于另一個(gè)10 mL試管中，氮?dú)饬飨?0℃水浴濃縮近干，殘液用1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液（V/V，5/5）溶解，過0.22μm濾膜，上儀器檢測(cè)。

1.3.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取不含待測(cè)藥物的小麥空白樣品，按“1.3.3”的提取和凈化方法得到空白基質(zhì)，用其稀釋2 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液，依次稀釋至100、50、20、10、5、2μg/L，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.5 液相條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH Shield RP18，2.1 mm×100 mm，1.7μm；色譜柱40℃；樣品室20℃；流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為0.1%甲酸水溶液；進(jìn)樣體積10μL；梯度見表1。

1.3.6 質(zhì)譜條件 離子源采用電噴霧離子源（ESI）正、負(fù)離子模式；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電離電壓3.0 kV；霧化氣流速1 000 L/h；錐孔氣流速30 L/h；離子源溫度150℃；霧化溫度500℃；各化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。

表1 流動(dòng)相梯度

表2 MRM質(zhì)譜采集參數(shù)

1.3.7 基質(zhì)效應(yīng) 通過試劑和基質(zhì)空白溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液線性回歸曲線斜率的比值，考察分析物的基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)斜率比超出0.8～1.2時(shí)，不適合使用試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

8種藥物均溶于乙腈和甲醇，鑒于乙腈具有更好沉淀蛋白質(zhì)的作用，選擇乙腈作為提取液中的有機(jī)相；小麥樣品含水量較低，并且部分藥物含有酸性基團(tuán)，為提高回收率，提取液中加入適量水或酸性水溶液。為此，試驗(yàn)考察了乙腈-水（85/15，V/V）、乙腈-水（50/50，V/V）、乙腈-水-甲酸（85/14/1，V/V/V）、乙腈-水-甲酸（50/49/1，V/V/V）4種提取液對(duì)8種藥物的回收率和提取效果，并通過基質(zhì)外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，當(dāng)使用沒有甲酸的提取溶液進(jìn)行提取時(shí)，伏馬毒素B1和伏馬毒素B2等藥物回收率低至50%以下，在使用含有甲酸的提取溶液進(jìn)行提取時(shí)，所有藥物回收率均在75%～110%，為便于濃縮提高靈敏度，最終選擇乙腈-水-甲酸（85/14/1，V/V/V）作為提取溶劑。

2.2 凈化材料的選擇

小麥富含糖和蛋白質(zhì)，其種皮也含有多種色素，酸性提取液偏黃色。為更多地去除提取液中雜質(zhì)，降低基質(zhì)效應(yīng)，減少對(duì)儀器污染，篩選了硅膠、石墨化碳和N-丙基乙二胺等作為凈化材料凈化提取液。結(jié)果表明，當(dāng)提取溶液為乙腈-水-甲酸（85/14/1，V/V/V）時(shí)，適量N-丙基乙二胺和硅膠作為凈化材料，回收率均可控制在70%～110%，但不能有效去除色素；石墨化碳能有效去除色素，當(dāng)5.00 mL提取液中使用30 mg石墨化碳時(shí)能取得較好的凈化效果，回收率控制在70%～120%。因此，最終選擇石墨化碳作為凈化材料，使用量為30 mg。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

8種藥物在色譜柱上的分離度及靈敏度與流動(dòng)相有很大的關(guān)系。為增強(qiáng)藥物的電離度，得到更好的靈敏度，試驗(yàn)對(duì)比了有機(jī)相為甲醇和乙腈，水相為純水和0.1%甲酸水溶液的4套體系，并優(yōu)化有機(jī)相和水相梯度。結(jié)果表明，甲醇、乙腈加純水作為流動(dòng)相時(shí)，伏馬毒素B1和伏馬毒素B2等藥物峰形較差；在流動(dòng)相中加入甲酸，所有藥物均能得到較好的峰形，當(dāng)有機(jī)相為乙腈時(shí)，藥物靈敏度和峰形均優(yōu)于甲醇作流動(dòng)相，所以最終選擇乙腈-0.1%甲酸水體系。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將8種藥物用乙腈稀釋配制成1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，流動(dòng)相采用乙腈+0.1%甲酸水溶液，通過自動(dòng)泵使標(biāo)準(zhǔn)溶液和流動(dòng)相混合注入質(zhì)譜，對(duì)化合物質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。通過全掃描確定8種藥物的母離子，二甲四氯的電離化模式為ESI-，其他藥物的電離化模式為ESI+。在負(fù)離子模式下，二甲四氯可產(chǎn)生穩(wěn)定靈敏度高的［M-H］-母離子；在正離子模式下，發(fā)現(xiàn)異丙隆、苯磺隆、芐嘧磺隆、伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、雜色曲霉毒素可形成穩(wěn)定靈敏度高的［M+H］+母離子，T-2形成的［M+H］+靈敏度偏低，但可得到穩(wěn)定靈敏度高的［M+Na］+和［M+NH4］+母離子，在正離子模式下母離子為［M+Na］+時(shí)靈敏度和信噪比更高。在確定各化合物母離子后，應(yīng)用儀器自帶的Intelli Start技術(shù)對(duì)藥物進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，得到藥物的定量和定性子離子，并確定相應(yīng)的錐孔電壓和碰撞能量，最終建立8種藥物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 基質(zhì)效應(yīng) 小麥富含各種營(yíng)養(yǎng)成分，提取液雖經(jīng)石墨化碳凈化，但殘留的雜質(zhì)仍可能具有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，影響藥物的檢測(cè)結(jié)果。為評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)，分別用試劑和小麥基質(zhì)空白溶液配制2～100μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，通過儀器分析后，用得到的線性回歸曲線計(jì)算斜率比值，結(jié)果見表3。由表3可以看出，異丙隆、苯磺隆、芐嘧磺隆、二甲四氯等藥物表現(xiàn)為基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，T-2表現(xiàn)為基質(zhì)效應(yīng)抑制，5種藥物斜率比均超出0.8～1.2的閾值，說明小麥樣液中仍有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。為此，最終選擇基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液定量。

表3 溶劑標(biāo)液和基質(zhì)標(biāo)液的線性回歸方程和斜率比

2.5.2 方法定量限和線性關(guān)系 用小麥基質(zhì)空白配制8種真菌毒素和除草劑的系列混合標(biāo)液，質(zhì)量濃度依次為2、5、10、20、50和100μg/L。結(jié)果表明，8種藥物在質(zhì)量濃度為2～100μg/L時(shí)，相關(guān)系數(shù)為0.997 2～0.999 9，線性關(guān)系良好。采用小麥空白樣品添加，10倍信噪比時(shí)添加濃度作為方法定量限，結(jié)果如表4所示，8種藥物定量限在0.4～2.0μg/kg。

2.5.3 回收率與精密度 稱取小麥空白樣品進(jìn)行回收試驗(yàn)，3個(gè)水平的添加濃度依次為5、20、80μg/kg，每個(gè)水平重復(fù)5次。結(jié)果表明，8種藥物的平均回收率為76.4%～114.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～9.2%（表4）。色譜見圖1至圖3。

圖1 基質(zhì)標(biāo)液MRM色譜

圖2 樣品空白MRM

圖3 添加樣品MRM

表4 8種藥物的添加回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和定量限

3 討論

小麥中除草劑和真菌毒素能同時(shí)檢測(cè)的方法較少，本試驗(yàn)選擇了4種在用除草劑和4種小麥易產(chǎn)生的真菌毒素作為研究對(duì)象。考慮小麥營(yíng)養(yǎng)成分和8種藥物分子結(jié)構(gòu)差異，篩選并優(yōu)化了提取溶液的組成、凈化材料及其使用量，以及液相色譜和質(zhì)譜儀器條件，建立了QuECHERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀同時(shí)測(cè)定小麥中8種除草劑和真菌毒素的分析方法。在方法驗(yàn)證中，通過對(duì)基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)，確定采用小麥基質(zhì)空白配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行外標(biāo)法計(jì)算，8種藥物在線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，所有藥物平均加標(biāo)回收率為76.4%～114.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～9.2%，定量限為0.4～2.0μg/kg。該法簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，滿足分析的要求，適用于小麥中8種藥物定性定量快速檢測(cè)。