GC-MS/MS分析中藥六方藤和山苦荬中46種禁限用農(nóng)藥殘留量

唐明華，蔣永寧，徐 夢(mèng)，盧桂健，梁 爽

（1.玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，廣西 玉林 537000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001）

六方藤（Cissus hexangularisThorel ex Planch）為葡萄科白粉藤屬植物翅莖白粉藤的藤莖［1］，具有祛風(fēng)除濕，活血通絡(luò)之功效，臨床用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，腰肌勞損，跌打損傷［2］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白粉藤屬植物具有多種潛在的抗菌、抗炎、抗氧化、抗過敏、抗腫瘤、拮抗內(nèi)皮素和治療糖尿病等生物活性［3］。六方藤化學(xué)成分復(fù)雜，含有糖類、苷類、皂苷類、鞣質(zhì)、黃酮類、酚類、蒽醌類、香豆素、強(qiáng)心苷、甾萜類、生物堿及揮發(fā)油等化學(xué)成分［4］。山苦荬［Ixeridium chinense（Thunb.）Tzvel.］為菊科小苦荬屬多年生草本植物［1］，以全草入藥，具有清熱解毒、止痛消腫、消炎涼血等功效，用于治療無名腫痛、腹腔膿腫、痢疾、關(guān)節(jié)炎等多種疾病［5］。現(xiàn)代藥理研究證明，山苦荬的化學(xué)成分具有抗炎保肝、抗氧化、抗煙堿、抗病毒、抗白血病等作用，其中黃酮類成分具有很強(qiáng)的藥理活性［6］。近10年來，國內(nèi)外學(xué)者從山苦荬中分離鑒定出了倍半萜類、三萜類、甾醇類、黃酮類等生物活性化學(xué)成分［7］。在中藥六方藤和山苦荬生長過程中，為消除病蟲草害，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，噴灑農(nóng)藥必不可少，然而施藥過程的不規(guī)范和不合理，常常使藥材中農(nóng)藥殘留超標(biāo)［8］。為保證消費(fèi)安全，國家加大了對(duì)藥材中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測力度，2020版《中國藥典》四部通則將33種禁用農(nóng)藥正式列入《0212藥材和飲片檢定通則》，不斷增多的檢測項(xiàng)目和日益嚴(yán)格的限量要求使農(nóng)藥殘留檢測工作面臨更加嚴(yán)峻的考驗(yàn)［9］。由于氣質(zhì)聯(lián)用儀具有高分辨率和高靈敏度，因此被廣泛應(yīng)用于分離與鑒定復(fù)雜組分，是中藥中農(nóng)藥殘留定性定量的最有效工具之一［10，11］。試驗(yàn)在中藥日常檢驗(yàn)項(xiàng)目的基礎(chǔ)上，剔除在質(zhì)譜上靈敏度較差的項(xiàng)目，最終確定46種農(nóng)藥品種作為目標(biāo)物。通過對(duì)前處理方法的提取溶劑、洗脫溶劑等方面進(jìn)行優(yōu)化，建立了準(zhǔn)確、可靠且能同時(shí)測定中藥六方藤和山苦荬中46種常見禁限用農(nóng)藥的多殘留檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 儀器 TRACE 1310-TSQ8000 Evo氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電子轟擊源（EI），美國Thermo Fisher公司；BSA822-CM型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；ROATNTA 460R型離心機(jī)，德國SIGMA公司；HYQ-3110型渦旋混勻器，美國精騏公司；N-EVAP-24型氮吹儀，美國Organomation公司。

1.1.2 材料和試劑 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：環(huán)氧七氯，德國Dr.公司，批號(hào)G121441；46種農(nóng)藥混標(biāo)溶液，100.0 μg/mL，F(xiàn)irst Standard公司生產(chǎn)，批號(hào)S001417，包括α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、苯醚甲環(huán)唑、丙溴磷、噠螨靈、對(duì)硫磷、敵敵畏、蟲螨磷、對(duì)硫磷、二甲戊靈、二嗪磷、伏殺硫磷、氟胺氯菊酯、氟氯氰菊酯、腐霉利、甲胺磷、甲拌磷、甲拌磷砜、甲基對(duì)硫磷、甲基異柳磷、甲氰菊酯、久效磷、樂果、聯(lián)苯菊酯、磷胺、硫丹、高效氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、馬拉硫磷、咪酰胺、醚菌酯、氰戊菊酯、三氯殺螨醇、三唑磷、三唑酮、殺螟硫磷、水胺硫磷、五氯硝基苯、溴氰菊酯、亞胺硫磷、氧樂果、乙烯菌核利、乙酰甲胺磷、異菌脲。乙腈、正己烷，色譜純，美國Thermo Fisher公司；無水硫酸鈉，分析純，廣州化學(xué)試劑廠，用前在650℃灼燒4 h，貯于干燥器中，冷卻后備用；QuECh-ERS萃取鹽包，美國Agilent公司，部件號(hào)5982-6755（含6 g無水MgSO4，1.5 g NaAc）；15 mL QuECh-ERS分散固相萃取管，美國Agilent公司，部件號(hào)5982-5456（含300 mg PSA，300 mg C18，90 mg GCB，900 mg無水MgSO4）。20批次中藥六方藤和山苦荬藥材樣品分別為衛(wèi)矛科雷公藤屬植物六方藤和菊科小苦荬屬的山苦荬全草，樣品信息見表1。

表1 六方藤和山苦荬樣品基源信息

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密量取1.0 mL 46種農(nóng)藥混標(biāo)溶液，置于20 mL容量瓶中，用丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（濃度均為5.0μg/mL）。再精密量取2.0 mL置10 mL容量瓶中，用丙酮定容，即得混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（濃度為1.0 μg/mL）。分別精密量取0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于6個(gè)2 mL容量瓶中，加乙腈定容至刻度，再加入0.1 mL濃度為1.0μg/mL的內(nèi)標(biāo)容液，搖勻，即得系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（濃度依次為50.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0 ng/mL，內(nèi)標(biāo)濃度為50.0 ng/mL）。

1.2.2 供試品溶液的制備

1）提取。稱取樣品2 g，于50 mL的聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，渦旋使藥粉充分浸潤，放置30 min，精密加入乙腈15 mL渦旋振蕩5 min，加入QuEChERS萃取鹽包，立即搖散，渦旋振蕩3 min，置冰浴中冷卻10 min，5 000 r/min離心5 min。

2）凈化。取上清液9 mL置于15 mL QuECh-ERS分散固相萃取管中。渦旋使充分混勻，再置振蕩器上劇烈振蕩5 min使完全凈化，離心5 min，精密吸取上清液5 mL，置氮吹儀上40℃水浴濃縮至近干，加入內(nèi)標(biāo)溶液0.1 mL，加乙腈定容至2 mL，渦旋混勻，經(jīng)微孔濾膜（0.22μm）過濾，取續(xù)濾液，裝瓶，即得。

1.2.3 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析條件

1）色譜條件。TG-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×250μm×0.25μm）。載氣為He（≥99.99%），柱流量1.2 mL/min，進(jìn)樣口溫度270℃，不分流，進(jìn)樣量1μL，溶劑延遲3.0 min。程序升溫：初始溫度40℃，保持1.5 min，以25℃/min升至90℃，保持1.5 min，以25℃/min升至180℃，以5℃/min升至280℃，以10℃/min升至300℃，保持5 min。

2）質(zhì)譜條件。EI源，電子能量為70 eV，燈絲電流25μA，離子源溫度為300℃，質(zhì)譜接口溫度為280℃，多反應(yīng)監(jiān)測（SRM）采集模式。Trace Finder軟件自帶的數(shù)據(jù)庫包含超過1 000種能在GC上分析的常規(guī)化合物，每種化合物都有3對(duì)離子對(duì)，其中響應(yīng)最高的一對(duì)為定量離子，其他兩對(duì)為定性離子。每個(gè)化合物SRM質(zhì)譜條件（母離子-子離子-碰撞能量）可以從Trace Finder軟件中的數(shù)據(jù)庫直接導(dǎo)出編輯進(jìn)樣方法和數(shù)據(jù)處理方法。46種農(nóng)藥的保留時(shí)間、SRM離子對(duì)信息、碰撞能見表2，目標(biāo)物的SRM總離子流見圖1。

表2 46種農(nóng)藥的保留時(shí)間、SRM離子對(duì)信息和碰撞能

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的總離子流

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測下限和精密度 將46種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液按試驗(yàn)條件進(jìn)行測定，以農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，以信噪比（S/N）=3確定檢測下限。結(jié)果表明，46種農(nóng)藥在50.0～300.0 ng/mL與目標(biāo)物的響應(yīng)值呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.990，方法檢出限為0.01～0.60μg/kg。取溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以各指標(biāo)色譜峰積分面積RSD計(jì)算精密度，精密度良好（RSD＜10%）。各指標(biāo)線性方程、精密度、相關(guān)系數(shù)、檢出限結(jié)果見表3。

表3 46種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)及定量下限

2.1.2 加標(biāo)回收率 加標(biāo)回收率試驗(yàn)設(shè)置高、中、低3個(gè)濃度水平，各濃度水平分別準(zhǔn)確稱取空白樣品5.0 g，分別精密加入“1.2.1”項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.06、0.12、0.24 mL，按照“1.2.2”制備加標(biāo)回收樣品溶液，每個(gè)級(jí)別平行制備2份，分別進(jìn)樣測定，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RAD），結(jié)果見表4。46種農(nóng)藥的平均回收率在48.6%～119.0%，相應(yīng)的RAD為0.1%～14.9%。

表4 加標(biāo)回收結(jié)果

2.2 樣品測定結(jié)果

試驗(yàn)采用上述樣品前處理方法以及色譜分離條件、質(zhì)譜檢測條件檢測了20批次六方藤和山苦荬樣品。結(jié)果表明，46種禁限用農(nóng)藥檢測指標(biāo)在10批山苦荬樣品中最終檢出5種，分別為蟲螨磷、高效氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、二甲戊靈、苯醚甲環(huán)唑。蟲螨磷在樣品S13、S16、S17中均有檢出，殘留量有較大差別，除S16外，其他樣品均低于5μg/kg，S13檢測出高效氯氟氰菊酯8.25μg/kg，S18檢測出二甲戊靈12.03μg/kg，S16分別檢測出蟲螨磷28.89μg/kg，氯氰菊酯19.52μg/kg，苯醚甲環(huán)唑24.30μg/kg。除S14外，其他樣品均低于5μg/kg；六方藤樣品中尚無檢出。

3 討論

中藥山苦荬及六方藤中農(nóng)藥殘留分析屬于痕量分析，其技術(shù)特點(diǎn)主要有樣品中農(nóng)藥的殘留量低，而干擾物如色素、揮發(fā)油等含量高，給測定帶來較大難度；農(nóng)藥品種繁多，用藥情況復(fù)雜，各類農(nóng)藥性質(zhì)差異較大。針對(duì)上述特點(diǎn)，分析時(shí)分4步進(jìn)行，第1步，確定測定目標(biāo)，調(diào)查山苦荬和六方藤農(nóng)藥污染情況，包括種植區(qū)環(huán)境特點(diǎn)、農(nóng)藥使用習(xí)慣和用藥歷史、輪作作物農(nóng)藥使用情況和常見病蟲害及其藥物防治方法。第2步，確定分析方法。色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)是目前最重要、應(yīng)用最廣泛的多農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)。以氣相色譜進(jìn)行分離，以靈敏度高、專屬性強(qiáng)的串聯(lián)質(zhì)譜儀作為檢測器測定，定性與定量可同時(shí)實(shí)現(xiàn)。建立分析方法時(shí)有3個(gè)方面需要優(yōu)化：①優(yōu)化儀器采集參數(shù)，對(duì)于GC-MS/MS方法，需要優(yōu)化的參數(shù)主要包括毛細(xì)管色譜柱的選擇、載氣流速、柱溫箱升溫程序、離子源參數(shù)、離子對(duì)選擇、碰撞電壓優(yōu)化和數(shù)據(jù)采集模式等；②優(yōu)化樣品前處理方法，根據(jù)樣品基質(zhì)的性質(zhì)，盡可能減少干擾物質(zhì)，保留目標(biāo)化合物。其中提取溶劑選擇（乙腈、丙酮）、提取方法（振蕩法、超聲波提取法）、凈化方法（固相萃取柱凈化法、固相分散萃取）是關(guān)鍵點(diǎn)，直接影響加標(biāo)回收率及方法檢出限和定量限；③采用適宜方法補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。樣品前處理方法會(huì)改善基質(zhì)效應(yīng)，為了抵消基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量準(zhǔn)確性的影響，一般采用空白基質(zhì)匹配法。第3步，方法學(xué)驗(yàn)證。主要包括線性、精密度、重復(fù)性、回收率、檢測限與定量限等。第4步，測定樣品。樣品在采集、制備、檢測時(shí)應(yīng)始終保持其原始特性，未受污染、變質(zhì)或混淆，尤其應(yīng)當(dāng)注意采樣代表性和取樣均勻性。檢測所得結(jié)果應(yīng)由保留時(shí)間和碎片豐度共同作為判定依據(jù)。