植物種子中氨基酸成分測定方法的比較分析

董玉迪 張 曼 田 娟 孫墨可 郭來春

（吉林省白城市農業科學院 吉林白城 137000）

植物是生態環境中十分重要的組成部分，也是人類重要的食物和營養來源。特別是在植物種子中，富含大量的氨基酸1-α、氨基-γ-（胍基氧基）、正丁酸及其他游離氨基酸，十分有益于人體健康，例如，1-瓜氨酸是非必需氨基酸卻時常參與器官間代謝，它也參與一氧化氮信號分子的產生，并且是有效的血管擴張劑。有鑒于此，對植物種子中的游離氨基酸進行分析對于確定植物種子的質量等非常重要[1]。由于氨基酸成分的測定方法很多，在實踐中研究人員很難選擇出恰當的測定方法，以保障植物種子的氨基酸測定在較大的線性范圍內，確保植物種子氨基酸成分測定的精度、準確性和可重復性。因此，迫切需要針對現階段常用的氨基酸測定方法加以比較。

1 氨基酸成分測定方法

現代氨基酸成分分析測定方法有很多，例如，毛細管電泳、氣相色譜、qNMR 和液相色譜等氨基酸成分測定方法[2]。用于氨基酸衍生化的試劑有6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯（AQC）、9-芴基甲基-氯甲酸酯（FMOC-Cl）、異硫氰酸苯酯（PITC）、丹磺酰氯（DNS）和鄰苯二甲醛（OPA）。由于酸性、堿性和中性行為及其關鍵對的存在，氨基酸的分離具有挑戰性。關鍵對緊密洗脫氨基酸衍生物，例如甘氨酸、β-丙氨酸和蛋氨酸。通過RP-HPLC 使用熒光（FLD）、紫外線和二極管陣列檢測器（DAD）進行氨基酸測定，通常在柱前衍生化后進行。但是，這些氨基酸成分測定方法或多或少都有弊端。例如，茚三酮雖然是最通用的檢測方法，但當需要定量低于100皮摩爾的氨基酸時，其有效性會下降；鄰苯二甲醛盡管具有出色的靈敏度，但亞胺酸定量分析效果較差；PTC 化學試劑提供了一種可行的替代方法，但是與樣品相關的基質效應會導致谷氨酸和天冬氨酸的回收率可變。

分析氨基酸純度，同樣有許多方法。例如，針對校準物雜質的紫外線檢測的高效液相色譜法（HPLC-UV/Vis）或具有火焰離子化檢測的氣相色譜法（GC-FID）等[3]。但是，這些方法通常會遭受非色譜分離的困擾，導致與雜質相關的巨大不確定性，使得雜質無法得到充分校準，必須再次進行來源或合成然后表征。因此，需要進一步開發用于氨基酸成分測定的方法。通過IEC結合茚三酮進行柱后衍生化測定氨基酸的方法，研究人員研制了全自動儀器，例如，日立L-8800 分析儀和日立L-8900 分析儀等，使這種分析在常規基礎上可行，將氨基酸測定提升到新的高度，并應用于許多領域的研究中。此外，將氣相色譜儀與同位素比值質譜儀（IRMS）儀器（GC-C-IRMS）連接起來的燃燒接口的概念，允許使用單個加標化合物對多種有機物進行柱后IDMS 分析，來確定同位素標記尖峰的質量流，并且可以在25 ℃下快速進行[4]。

2 氨基酸成分測定方法的比較

2.1 使用方法的比較

使用C 8 色譜柱分離氨基酸，并通過HPLC-FLD 進行氨基酸成分測定需要使用到氨基酸標準品、三水合乙酸鈉、鹽酸、2-巰基乙醇、HPLC 級甲醇、乙腈、β-丙氨酸和OPA、1-鳥氨酸、冰醋酸、Brij-35、硼酸鈉、HPLC 級水。首先將50 mg OPA溶于1.25 mL HPLC級甲醇中，然后將11.1 mL 40 mmol/L 硼酸鈉，0.5 mL 3.1%Brij-35 和50 μL 2-巰基乙醇（ME）溶解。

使用HPLC 系統分離氨基酸。通過由Instant Pilot 型號G4208 A 控制的1260 Infinity 熒光檢測器進行檢測[5]。該系統對PE Nelson 900 接口和PE Nelson 600 鏈接盒進行了調整。流動相由（A）20 mmol/L 乙酸鈉緩沖液和（B）乙腈/甲醇/水（50 /32 /18）組成。通過以下梯度程序實現了28 分鐘的氨基酸分離：等度20% B，持續4 分鐘，在2分鐘內從20%B 逐漸增加到32% B，4 分鐘內從32%～34% B 逐漸增加，然后增加3 分鐘，從34% B 增至38% B，然后在9 分鐘內線性增加至95% B，保持等度5% B 2 分鐘，然后在1 分鐘內恢復到初始狀態20% B 并保持等度4 分鐘。流速為0.6 mL / min，進樣量為5μL。衍生化過程是自動化的；在進樣之前，將100 μL OPA 的等分試樣用自動進樣器吸收，并添加到含有果汁樣品或氨基酸標準溶液的HPLC 小瓶中。將OPA 樣品混合物在25±1 ℃下孵育2 分鐘。然后立即通過HPLC-FLD 分析反應混合物。為了檢測氨基酸，將熒光檢測器的激發和發射分別設置在340 nm 和455 nm。

使用NHS-醋酸鹽和DEPC 進行氨基酸測定需要使用到NHS-醋酸鹽、DEPC、咪唑、用于MS 的所有溶劑和添加劑（HPLC 級）。將15 mmol/L NHS 乙酸酯溶于33%（體積比）乙腈（ACN）中，并用水按1:10 稀釋。將PBS中的50 pmol ADH或PK 與0.1%的NHS-乙酸鹽混合，最終體積為20 μL，并在23 ℃下孵育15 分鐘。隨后，添加NuPAGE LDS 樣品緩沖液和還原劑，并使用NuPAGE Bis-Tris 凝膠進行凝膠電泳。用NHS-乙酸酯標記的蛋白質在凝膠中水解。為此，從凝膠上切下蛋白條帶，然后用10 mmol/L 二硫蘇糖醇還原蛋白，用55 mmol/L 碘乙酰胺烷基化，并用胰蛋白酶（Roche）水解。用水將DEPC 稀釋至0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、2.5 mmol/L 和5 mmol/L。將HEPES 中的50 pmol ADH 或PK 與0、2、10、50 和100 摩爾過量的DEPC 混合，并在37 ℃和500 rpm 下孵育1 分鐘。通過在冰上添加1μL 10 mmol/L咪唑來終止標記反應。隨后，將蛋白質以3 體積沉淀。100%（體積比）冰冷的乙醇和1/10 體積0.5 mol/L 乙酸鈉pH 5.3，然后在-20 ℃下孵育2 小時。離心分離蛋白質，并用80%（體積比）乙醇洗滌沉淀，并在真空離心機中干燥。將通過凝膠水解或溶液水解獲得的肽溶解在2%（體積比）ACN / 0.1%（體積比）FA 中，并加載到反相C18 預柱濃縮肽。使用0.1% FA（體積比）作為流動相A，使用80%（體積比）ACN / 0.1%（體積比）FA 作為流動相B，然后在反相C18 分析柱上分離多肽，在70 分鐘內以300/min 的流速以90%乙醇的梯度洗脫。將這些肽直接洗脫到Q Exactive Plus 混合四極桿Orbitrap 質譜儀中，并以數據依賴模式進行分析。

2.2 測定結果的比較

使用C8 色譜柱分離氨基酸，并通過HPLC-FLD 進行氨基酸成分測定將儲備溶液進一步稀釋以制成最終濃度為2.5 μg/mL 的溶液。然后將最終濃度依次稀釋為0.08μg/ mL、0.16μg/ mL、0.32μg/ mL、0.64μg/ mL、1.28μg/ mL，用于校準曲線。通過注入5μL 連續稀釋的標準溶液評估不同氨基酸的校準曲線的線性。通過繪制HPLC 峰面積相對于其濃度的曲線來獲得校準圖。分別以3 和10 的信噪比（S /N）確定檢測限（LOD）和定量限（LOQ）。通過標準氨基酸混合物和樣品的重復性和中間精度評估優化該方法的精度。該方法的可重復性通過連續3 天每天從預定的連續進樣（n= 5）中獲得的單個峰面積的相對標準偏差（%RSD）進行評估。

使用NHS-醋酸鹽和DEPC 進行氨基酸測定，在評估標記氨基酸的反應性時，幾乎所有的氨基酸都被NHS-乙酸鹽和DEPC 標記，這表明氨基酸的反應性很高。從技術角度來看，NHS-乙酸酯標記的可重復性高于觀察到的DEPC 標記。相較于以前的結果，在評估賴氨酸殘基的標記百分比時，似乎經常在NHS 標記中觀察到較高的標記百分比；對于少量氨基酸，使用DEPC 時觀察到更高的標記百分比。通過儀器徹底轉移纈氨酸的進一步檢查，將使用與色譜柱后IDMS 相同的色譜法（但不添加峰）的纈氨酸的碳同位素增量與離線獲得的相同同位素增量進行比較。如果這兩個同位素δ值之間存在顯著差異，則纈氨酸中的少量雜質具有高度異常的同位素δ值，或者在色譜分離過程中存在纈氨酸的分餾現象。

3 結論

植物種子的氨基酸成分測定，關鍵在于衍生試劑的選擇。選擇衍生試劑的標準是能與各氨基酸定量反應，每種氨基酸只生成一種化合物且產物有一定的穩定性，不產生或易于排除干擾物；操作簡單，色譜分離分辨率高，檢測靈敏度高，分析時間短，便于實現自動化和使產物能在不同型號的高效液相色譜儀上測定。當然，不同衍生物所選用的柱型、流動相以及氨基酸的洗脫時間和順序也不盡相同。