基于核磁共振和氣質聯用技術對花生發芽及其風味的分析

樊 艷

(南京財經大學食品科學與工程學院；江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心；江蘇省高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210046)

我國是花生最大的生產國之一，花生資源豐富，品種繁多，按種皮顏色大致可分為紅皮花生和黑皮花生[1]。花生仁發芽長出嫩苗的過程稱為花生發芽，研究表明芽菜含有多種有益人體健康的營養素[2]，種子在萌發期間會使大分子物質降解為小分子物質從而更容易被人體吸收，且加工簡單、食用安全，深受市場喜愛。目前，對花生發芽過程的研究多數聚焦在其營養成分及功能性化合物含量的變化上[3-5]，而采用低場核磁共振儀分析花生浸種時間對發芽率影響的研究文獻不多，對發芽花生的氣味研究也鮮有報道。因此，本實驗以紅皮和黑皮花生種子為材料，研究浸種期間水分在種子內部的相態及其分布狀態，以及浸種時間和發芽率的關系和發芽花生的氣味，為其資源的充分利用提供實驗數據，對開展花生發芽及其營養物質的變化和深加工具有很大的意義。

低場核磁共振及其成像技術作為一種檢測手段，相較于傳統的水分測定方法具有操作簡單，無試劑污染，且對樣品無損等優勢，近年來被越來越多應用于食品加工處理過程水分的遷移研究[6-9]，使用該技術以氫核為研究對象可以充分了解水分子在樣品中的分布遷移情況和實際存在狀態。為更進一步了解花生發芽期間可食用部分的香味組成及其含量，本實驗采用氣質聯用儀來分析，并用保留指數進行定性，增加結果準確性。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為2019年新上市的帶殼鮮花生，包含紅皮花生和黑皮花生。

1.2 儀器與設備

MGC-450HP智能人工氣候箱，NMI20低場核磁共振儀，7890A-5875C氣質聯用儀，多功能樣品處理平臺(MPS)，含固相微萃取(SPME)裝置，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

參考楊天等[10]的方法，花生剝殼后篩選出顆粒飽滿且無壞損的種子，經超純水清洗后浸泡在1%(V∶V)濃度的次氯酸鈉溶液中，30 min后用超純水沖洗3次，再放入裝有超純水的玻璃杯中避光浸泡，浸泡時間參照茹萬飛[11]的實驗方法，分別在5、6、7、8 h后取出進行核磁共振檢測和發芽培養。浸泡后的花生種子單層均勻平放于底部有小孔的育苗盤里，表面覆蓋浸潤的紗布，放入智能人工氣候箱(30±2) ℃，(85±5)%RH中發芽，每隔8 h噴濕1次，發芽時長為6 d。

1.3.2 核磁共振檢測

線圈直徑為15 mm，磁體溫度為32 ℃，共振頻率為21.960 MHz，磁體強度為0.52 T；利用低場核磁共振儀分析軟件中的FID(free induction decay)脈沖序列尋找磁場的中心頻率及硬脈沖寬，利用硬脈沖回波序列CPMG(carr-purcell-meiboom-gillsequence)采集花生的橫向弛豫時間T2圖譜， CPMG參數為SF=19 MHz，P1=13 μs，TD=300 090，SW=200 kHz，RFD=0.5 ms，RG1=20 db，TW=1 500 ms，P2=26 μs，TE=0.2 ms，NECH=7 500，NS=32。每個樣品測5次，將采集生成的自旋回波信號導入核磁共振反演擬合軟件各自反演，反演方法為SIRT。

發芽率測定參照GB/T 5520—2011《糧油檢驗 發芽試驗》，Y=M2/M，式中：Y為籽粒發芽率/%，M2為發芽率天數內的全部正常發芽粒數，M為一組試樣籽粒數。

1.3.3 揮發性組分測定

在林茂等[12]方法上稍作改變，稱取3.00 g樣品于20 mL頂空瓶中，MPS保溫箱溫度為60 ℃，平衡20 min，萃取30 min(萃取頭進樣前260 ℃老化30 min)，解析240 s，進行GC-MS分析；色譜柱采用DB-5 MS(30 m×250 um×0.25 um)，載氣為氦氣(純度≥99.999%)，流速1.0 mL/min，進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，柱溫60 ℃，保持2 min，3 ℃/min升到85 ℃，保持3 min，4 ℃/min升到230 ℃, 保持5 min，后運行溫度260 ℃，運行2 min，傳輸線溫度280 ℃，離子源為EI，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量是70 eV，采集模式為全掃描(Scan)，掃描質量范圍是45～450 amu。

1.4 數據處理

核磁共振儀采集的信號導入儀器自帶的反演擬合軟件進行反演，剔除離散性較大的數據，取平均值作為樣本的弛豫時間和信號幅度；發芽花生經GC-MS分析，對產生的總離子流圖對照標準譜庫NIST08.L進行檢索，匹配度≥80，并在與樣品色譜相同的條件，按烷烴標準品數據信息計算保留指數[14,15]，與其他文獻測定的RI值進行對比確認和人工解析，對樣品的揮發性組分進行定性；采用峰面積歸一化法進行定量，計算得到各組分的相對含量。數據采用Origin Pro2018C制表繪圖。

2 結果與分析

2.1 花生浸種期間種子水分的存在狀態

圖1為花生浸種過程弛豫時間T2和信號幅度的關系圖，根據核磁共振原理可知，通過測量T2及其幅值能夠獲得水分在花生中的相態分布信息和含量情況，水分的自由度隨T2的大小不同而不同，T2越小說明水和物質的結合程度越高，反之越低，所以T2能夠間接表明水分在樣品中的存在狀態[16]。本實驗中花生吸水后每個反演譜曲線上有3個波峰，弛豫時間從小到大T21(0.6～2.7 ms)、T22(7.1～65.8 ms) 和T23(86.9～705.5 ms)分別對應結合水、自由水、油脂的弛豫峰[21]。

圖2可見浸種過程T21峰面積變化幅度不大，表明在此期間種子中的結合水牢牢吸附在內部有機物上，沒有發生明顯變化；T22峰面積從浸種開始便急速吸水，表明種子內部的自由水含量不斷增加，細胞活性增強，流動性和可遷移性均增強，7 h后趨于平穩；浸種期間油脂和水分相互作用，T23峰面積變化有增有減，后期逐漸下降，這與付曉記等[17]的研究結果相似。實驗結果表明浸種時間會影響花生的水分遷移。

圖2 T21、T22、T23隨浸種時間變化曲線

由圖1和圖2可見，兩個品種花生T21和對應的弛豫譜信號幅值(峰面積)變化均不大，說明花生種子在浸種期間，與種子結合的水分含量整體穩定；紅皮花生T22橫向弛豫時間向右移動，對應的弛豫譜信號幅值不斷增加，表明該品種花生在浸種期間種子內部的自由水流動性增強，含量增加，黑皮花生T22橫向弛豫時間變化不大，對應的弛豫譜信號幅值迅速增加，浸種6 h達到峰值。

圖3顯示浸種時間為0、5、6、7、8 h五個不同時間點的偽彩圖。MRI成像能反映樣品中氫質子的分布，氫質子越密集區域質子密度加權像越明亮[18]。圖像顯示，浸種過程中水最先從花生胚端進入種子，之后種子快速吸水，水分逐漸向內部和外部遷移擴散，8 h后內部水分逐漸向外擴散。

水分是種子萌發的首要條件，自由水的存在是種子生命活躍度提升的必要條件[8]。一般花生種子需要吸收相當于種子風干質量的40%～60%的水分才開始萌動[18]。

2.2 花生發芽期間芽長和芽粗的生長規律

發芽培育的第6天，根據GB/T 5520—2011測不同品種花生在浸種時間分別為5、6、7、8 h的發芽率。實驗結果表明兩個品種花生的發芽率都在90%以上。花生種子的浸泡時間不同，發芽率不同，并且花生品種不同發芽率也各異。隨著浸泡時間的加長，發芽率逐漸增加，紅皮花生種子浸泡7 h的花生種子發芽率可以達到95%以上，浸種8 h的發芽率有所下降；黑皮花生種子在浸泡6 h時發芽率達到98%，浸種7 h和8 h的發芽率略有下降。所以，本實驗選擇的紅皮和黑皮花生浸種時間分別為7 h和6 h。

由圖4可知，花生種子發芽培養第1天生長緩慢，從第2天開始變化顯著，芽長在第3～5天迅速增長，在第5天黑皮花生平均芽長最大，達到了58 mm，第6天趨勢平緩；芽粗在第3～4天增長迅速，第5天趨勢平緩，紅皮花生和黑皮花生的平均芽粗分別為5.7 mm和5.8 mm。于麗娜等[19]檢測了5個不同品種花生在6 d的發芽期內芽長和芽粗的生長情況，發現芽長和芽粗的增長態勢均呈現先緩后長再平的一個整體趨勢，本研究的實驗結果與之相似。

圖4 不同品種花生發芽時間和芽長/芽粗的關系

2.3 發芽花生可食用部分的主要揮發性組分分析

由于花生發芽第1天的芽苗平均芽長不到2.5 mm，所以從發芽第2天開始取樣進行GC-MS的檢測，結果如表1和圖5所示。

表1 不同品種花生發芽期間可食用部分主要揮發性組分的相對含量/%

續表1

圖5 不同品種花生發芽期間揮發性化合物總量的變化

檢測結果顯示，不同品種花生在發芽期間芽苗可食部分的揮發性成分及其相對含量有所差異，其主要成分有8種，包含醇、醛、烷烴、酯、芳香族、烯烴、有機酸和雜環類化合物，前三類化合物在不同品種的花生發芽期間均有檢出，其中，烷烴類化合物由于感覺閾值很高[24]，一般無明顯嗅感；醛類化合物的相對含量明顯高于其他兩類化合物，紅皮花生在發芽前5天的醛類化合物質量分數均超過了50%，第6天下降到29%，黑皮花生在發芽前5天的質量分數在33%以上，第6天下降到25%，可見，不同品種花生發芽前5天醛類化合物的總量都具有一定的穩定性；反-2-壬醛和壬醛分別是紅皮和黑皮花生芽苗中含量最高的醛類化合物。研究表明，醛類化合物的產生可能與氨基酸代謝有關，花生發芽后苯丙氨酸的含量明顯增加[25]，苯丙氨酸經脫氨脫羧后形成苯乙醛，紅皮和黑皮花生芽苗中的苯乙醛質量分數分別在13%和10%以上；醛類化合物閾值很低[26]，對發芽花生風味貢獻較大，是發芽花生風味成分中最重要的一類化合物，一般認為普通醛類化合物可帶來清新的味道[27]。醇類化合物有支鏈醇2種，芳香醇1種，不飽和醇2種和脂肪醇3種，它們在紅皮花生芽苗中質量分數是黑皮花生芽苗中的0.70～5.32倍，一般認為醇類化合物是脂類氧化作用的產物[28]；從化合物嗅感特征分析，直鏈飽和醇的感覺閾值在500～20 000 μg/kg之間，相對其他羰基化合物較高，其香氣對花生芽苗的風味貢獻很小，但隨著碳鏈的增長，香味增加，會產生清香、木香、脂肪香的特征，含苯環的化合物會產生良好的風味[29]，不飽和醇閾值較低[30]，從表1中可以看出，具有橘皮香的S-(Z)-3,7,11-三甲基-1,6,10-十二烷三烯-3-醇在紅皮花生發芽的第3、4、5天均有被檢測到，具有茶清香的反-2-癸烯醇只在黑皮花生發芽的最后2天被檢測到，具有玫瑰花樣清香的β-苯乙醇在紅皮和黑皮花生芽苗中都有檢出，后者的含量略高于前者；紅皮花生芽苗中的短鏈飽和醇2-乙基己醇質量分數較高，占醇類總量的88%以上(第4天除外)，但由于其閾值極高[20]因此對整體風味的貢獻并不大。酯類化合物在黑皮花生芽苗中的質量分數都在17%以上，其中，二乙二醇單硬脂酸酯和三聚氰酸丙酯在黑皮花生芽苗中的含量相對穩定，在紅皮花生芽苗中未被檢測到，二乙二醇單硬脂酸酯屬于分子量較大的烷基酯，它的出現可能與脂肪的降解有關[31]，王小燕等[32]的研究發現花生發芽期間脂肪水解為發芽提供營養物質，脂肪含量下降。

分析結果表明，揮發性醇類和醛類化合物是花生發芽期間的關鍵性嗅感物質，從圖6中可以更直觀地看出這兩類揮發性物質中某些化合物的變化趨勢。醇類化合物中，紅皮花生芽苗中的2-乙基己醇的含量顯著高于黑皮花生芽苗中的含量以及同品種花生芽苗中其他醇的含量，發芽期間其含量呈先升后降再升的波動變化趨勢，黑皮花生芽苗中含量較高的物質是β-苯乙醇，呈先升后降的變化趨勢；醛類化合物中，紅皮花生芽苗的反-2-壬醛含量相對較高，發芽過程中整體呈下降趨勢，黑皮花生芽苗中壬醛的質量分數高于其他醛的含量，在12.25%～15.58%范圍內呈小幅度的波動變化趨勢。

圖6 不同品種花生發芽期間醛類化合物的含量變化

3 結論

采用低場核磁共振儀測定弛豫時間和核磁成像技術研究花生浸種期間不同相態水分的分布變化及其含量變化，發現紅皮花生在浸種期間種子內部的自由水流動性增強，含量增加，黑皮花生浸種6 h達到峰值；浸種過程中水最先從花生胚端進入種子，之后種子快速吸水，水分逐漸向內部和外部遷移擴散，8 h后內部水分逐漸向外擴散。

采用氣質聯用技術對花生發芽期間可食部分的香氣成分進行檢測分析，發現不同品種花生在發芽期間芽苗可食部分的揮發性成分及其相對含量有所差異，各揮發性化合物在發芽期間的總量變化有增有減，無顯著規律。醇、醛、烷烴類化合物在不同品種的花生發芽期間均有檢出。