肉桂精油納米乳液的抑菌性和穩(wěn)定性研究

侯克洪 馮 瀟 高成成 湯曉智

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210023)

植物精油是從植物的花、葉、莖、根或果實(shí)中提取的含有揮發(fā)性芳香物質(zhì)的濃縮親脂液體，其中的活性成分抗菌性強(qiáng)，是良好的天然抗菌劑[1]。然而，精油的強(qiáng)揮發(fā)性和疏水性以及其對(duì)環(huán)境如氧氣、光、穩(wěn)定的高敏感性限制了精油在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

利用納米乳液包埋精油并應(yīng)用于食品的抗菌保鮮已經(jīng)有大量的報(bào)道[2-4]。納米乳液載體的運(yùn)載效應(yīng)使被包埋的脂溶性成分的水溶解度顯著提高，而且穩(wěn)定性也有所提高。此外，由于液滴尺寸較小，顆粒光散射波較弱，使乳液呈現(xiàn)透明或僅輕度混濁狀態(tài)，在飲料或某些食品中添加時(shí)不改變其光學(xué)性質(zhì)[5]。然而，油水兩相界面間較高的正自由能決定了納米乳液是一種熱力學(xué)不穩(wěn)定性的體系，并可能因重力分離、凝聚、聚集、奧氏熟化等作用而發(fā)生破乳現(xiàn)象，因此如何制備具有較好穩(wěn)定性的納米乳液是目前研究的熱點(diǎn)。改善納米乳液的穩(wěn)定性可通過(guò)控制其油/水相組成、粒徑分布以及加入穩(wěn)定劑，如乳化劑、品質(zhì)改良劑或緩凝劑等實(shí)現(xiàn)[6]。

酪蛋白酸鈉是常用的天然高分子乳化劑。酪蛋白酸鈉已被報(bào)道可以降低界面張力，并且相對(duì)于球蛋白如乳清蛋白在界面處更易于展開，從而起到穩(wěn)定乳液的效果[7-8]。羥丙基-β-環(huán)糊精(HPCD)是β-環(huán)糊精(β-CD)的醚化衍生物。羥丙基的引入部分打開了β-CD的分子內(nèi)氫鍵，水溶性大大提高(>500 g/L，20 ℃)。與β-CD母體相比，HPCD在提高包埋物的溶解度、溶出速度、生物利用度和穩(wěn)定性方面都有獨(dú)特的作用，是目前研究及應(yīng)用最為廣泛的β-CD衍生物[9]。HPCD具有較β-CD更高的安全性，被認(rèn)為是很有潛力的母體環(huán)糊精替代品[10]。然而，研究者往往更多關(guān)注其包合特性，反而忽略了其非包合方面的特性，比如其類似于表面活性劑的親疏水特性[11]。由于HPCD 具有親脂的內(nèi)部空間和親水的外部空間，可以將其理解為一個(gè)特殊的表面活性劑，水不溶性的精油可以進(jìn)入親脂的內(nèi)部空間，與HPCD 形成水溶性復(fù)合體，從而增強(qiáng)乳液的穩(wěn)定性。因此，本研究使用HPCD與酪蛋白酸鈉共同乳化制備肉桂精油納米乳液，研究HPCD和酪蛋白酸鈉的添加量對(duì)乳液粒徑的影響，并在此基礎(chǔ)上，探究不同精油添加量下乳液的穩(wěn)定性和抑菌性能，旨在為制備高穩(wěn)定性且具備良好抑菌性能的精油納米乳液提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂精油，食品級(jí)；羥丙基-β-環(huán)糊精，純度97%；酪蛋白酸鈉，食品級(jí)；尼羅紅，純度≥95%。

1.2 儀器與設(shè)備

ULTRA-TURRAX T18高速分散器；SCIENTZ-1500F 超聲波分散儀；Nano-ZS90 納米激光粒度儀；AxioScopeA1熒光顯微鏡；HWS型恒溫恒濕箱；GHP-250智能光照培養(yǎng)箱； SpectralMax-M2e酶標(biāo)儀。

1.3 方法

1.3.1 乳液的制備

室溫下將HPCD溶解于純水中，再添加酪蛋白酸鈉充分溶解后，逐滴加入肉桂精油，繼續(xù)攪拌2 h，高速分散器18 000 r/min條件下處理5 min，最后在450 W功率下，超聲處理10 min。其中酪蛋白酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%(m/m)，肉桂精油的體積分?jǐn)?shù)為1%、3%、6%、10%(V/V)，HPCD的質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇前期實(shí)驗(yàn)中效果最好的3%(m/m)。

1.3.2 平均粒徑和多分散指數(shù)(PDI)分析

用納米激光粒度儀測(cè)量乳液平均粒徑和PDI。使用去離子水以1∶100稀釋樣品并充分?jǐn)嚢枰员苊舛啻紊⑸湫?yīng)，根據(jù)米氏散射理論，選擇折射率為1.456和吸收系數(shù)為0.001。

1.3.3 抗菌活性

參考Moraes-Lovison等[12]的方法，稍作修改，研究乳液對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)和金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus，S.aureus)的抗菌活性。使用LB肉湯，接種微生物后置于恒溫振蕩箱中，150 r/min、37 ℃下培養(yǎng)24 h，將菌濃度稀釋至108CFU/mL。取1 mL稀釋好的菌液與8.5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯和0.5 mL樣品乳液(對(duì)照組為0.5 mL無(wú)菌水，其他操作相同)，混合振蕩30 s，然后37 ℃下培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定混合液的菌濃度。

1.3.4 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

參考Rakmai等[13]的方法，通過(guò)微量稀釋法測(cè)定最小抑制濃度。將微生物濃度稀釋至約為105CFU/mL備用，取0.5 mL的每種細(xì)菌接種物接種2.5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯。然后將不同體積分?jǐn)?shù)的精油(溶于10%的乙醇溶液)或納米乳液加入管中，旋渦攪拌30 s。將混合液在37 ℃下培養(yǎng)24 h后未觀察到可見微生物生長(zhǎng)(OD600變化≤0.05)的最低濃度為精油和納米乳液的最小抑菌濃度(MIC)。將在OD600下顯示無(wú)濁度的培養(yǎng)液中的測(cè)試微生物培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移100 μL并涂布在PCA營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，37 ℃培養(yǎng)24 h，不生長(zhǎng)微生物的對(duì)應(yīng)濃度作為最小殺菌濃度(MBC)。

1.3.5 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

將新鮮制備的乳液分別放在4、25、40 ℃環(huán)境下，儲(chǔ)存28 d，每隔7 d測(cè)量粒徑，進(jìn)行拍照和熒光顯微鏡觀察。

1.3.6 乳化指數(shù)

乳化指數(shù)間接表明了乳液的穩(wěn)定性。參考Cheong等[14]的方法，乳液制備完成后，立即將10 mL納米乳液轉(zhuǎn)移到試管中密封，然后分別在4、25、40 ℃下儲(chǔ)存。乳化指數(shù)通過(guò)公式測(cè)定：

乳化指數(shù)=(HL/HE)×100%

式中：HL為奶油層的高度；HE為乳劑的總高度。

1.3.7 熒光顯微鏡

用適量尼羅紅溶液(0.1 mg/mL，溶于乙醇)對(duì)乳液預(yù)先染色，在熒光顯微鏡下觀察被染色的油滴形態(tài)大小，記錄圖像。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析分析組間差異性，以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒度和電位測(cè)量

表1顯示了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%、1.5%酪蛋白酸鈉(SC)單獨(dú)或與HPCD共同作用下不同肉桂精油含量的乳液粒徑和PDI。由表1可知，酪蛋白酸鈉可以用于穩(wěn)定肉桂精油納米乳液，當(dāng)使用0.5%的酪蛋白酸鈉時(shí)，乳液粒徑范圍在226.93～350.10 nm，PDI范圍在0.20～0.31，但粒徑和PDI隨著精油濃度的增加而增加。表明在較低SC濃度下，隨著精油濃度增加，沒(méi)有足夠的SC分子完全覆蓋乳液液滴，乳液由于聚結(jié)而不穩(wěn)定，其粒徑和PDI有所增加[11]。當(dāng)酪蛋白酸鈉使用量由0.5%增加到1.0%時(shí)，可以看到在較低精油濃度時(shí)粒徑無(wú)顯著變化，但當(dāng)精油體積分?jǐn)?shù)增加到10%(V/V), 相對(duì)于0.5%的酪蛋白酸鈉，1.0%酪蛋白酸鈉穩(wěn)定的精油乳液粒徑顯著降低。當(dāng)繼續(xù)增加酪蛋白酸鈉到1.5%，乳液粒徑反而有所上升。因?yàn)槔业鞍姿徕c是一種柔性蛋白，通過(guò)降低界面張力，并在油水界面處展開來(lái)穩(wěn)定乳液，當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)，酪蛋白酸鈉分子游離在溶液中，無(wú)法吸附到界面處起到穩(wěn)定乳液的作用，反而使乳液的粒徑增加[7]。

表1 不同SC濃度時(shí)不添加或添加HPCD乳液的粒徑和PDI

HPCD的添加可以顯著降低酪蛋白酸鈉-精油乳液的粒徑及PDI值，相較僅使用1%酪蛋白酸鈉穩(wěn)定的乳液粒徑，當(dāng)使用1%酪蛋白酸鈉和3%HPCD共同穩(wěn)定乳液時(shí)粒徑降低到198.57～233.93 nm。其可能原因在于HPCD對(duì)精油的包合特性抑制了精油的聚集[13,15-16]。此外，HPCD包合精油生成的復(fù)合物，可能通過(guò)吸附在油滴表面增強(qiáng)其乳化穩(wěn)定性，起到輔助其他乳化劑降低乳液粒徑穩(wěn)定乳液的效果。

2.2 抑菌生長(zhǎng)曲線

1%酪蛋白酸鈉和3%HPCD共同穩(wěn)定的肉桂精油納米乳液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌曲線如圖1所示。與對(duì)照組相比，添加納米乳液后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)受到明顯抑制，并且隨著精油添加量的增加，乳液對(duì)微生物的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。精油納米乳液的抑菌主要取決于基質(zhì)中精油的濃度、粒徑以及乳液中精油的釋放速度。當(dāng)乳液添加進(jìn)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中，由于水包油乳液的水溶性與分散性良好，納米級(jí)粒徑的精油液滴呈現(xiàn)較高的比表面積，增大了與微生物的接觸機(jī)會(huì)，因此當(dāng)與生物系統(tǒng)相互作用時(shí)呈現(xiàn)增強(qiáng)抑制的功能[17]。并且隨著時(shí)間的推移精油從納米乳液中持續(xù)釋放，延長(zhǎng)了精油作用于微生物的時(shí)間。當(dāng)精油添加量為10%時(shí)，可以看到大腸桿菌的濃度降低了2.62 lg(CFU/mL)，金黃色葡萄球菌的濃度降低了0.85 lg(CFU/mL)，并在72 h內(nèi)保持殺菌效果。

圖1 乳液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌生長(zhǎng)曲線

肉桂精油納米乳液對(duì)大腸桿菌的抑制作用強(qiáng)于金黃色葡萄球菌。革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽(yáng)性菌更敏感，可能是因?yàn)楦锾m氏陰性菌的外膜和內(nèi)膜都有精油主要成分(肉桂醛)的靶位點(diǎn)，并且一旦外膜被破壞，細(xì)胞質(zhì)膜就容易接近并破壞，造成細(xì)胞質(zhì)外泄，從而達(dá)到更強(qiáng)殺菌效果[18]。

2.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

最小抑菌濃度(MIC)是指抗菌劑能抑制微生物生長(zhǎng)的最低濃度，最小殺菌濃度(MBC)是指抗菌劑能殺死微生物的最低濃度，MIC和MBC都可以用來(lái)評(píng)價(jià)抗菌劑的抑菌和殺菌作用的強(qiáng)弱，其數(shù)值越小，代表抗菌劑的作用越強(qiáng)。如表2所示，與純?nèi)夤鹁拖啾龋夤鹁图{米乳液的MIC和MBC均降低，表明精油以納米乳液形式存在顯著增強(qiáng)了其抑菌性，也意味著可以適當(dāng)調(diào)整精油的使用量達(dá)到同樣的抑菌效果，從而一定程度上降低精油特殊的風(fēng)味對(duì)于食品體系的影響。精油納米乳液比純精油具有更好的水溶性、分散性以及更高的比表面積，增大了與微生物的接觸機(jī)會(huì)，此外，具有納米級(jí)別液滴的乳液有可能通過(guò)細(xì)菌外膜的孔蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，從而提高精油的遞送效率并帶來(lái)更高的抗微生物活性[19-20]。

表2 肉桂精油、HPCD和肉桂精油乳液的MIC和MBC

2.4 貯藏穩(wěn)定性

4、25、40 ℃是食品加工貯藏中的幾個(gè)常用溫度。1%酪蛋白酸鈉和3%HPCD共同穩(wěn)定的肉桂精油納米乳液在4、25、40 ℃下貯藏28 d的粒徑變化如圖2所示。當(dāng)精油添加量為1%、3%和6%時(shí)，乳液的粒徑在不同溫度下儲(chǔ)存均沒(méi)有明顯變化，表明在這些精油體積分?jǐn)?shù)下納米乳液的穩(wěn)定性良好。當(dāng)精油體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，在儲(chǔ)存的最初7 d內(nèi)，液滴的粒徑大小增加迅速，但7 d后，粒徑增長(zhǎng)變緩，乳液趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)樵贠/W乳液體系中形成液滴時(shí)，新形成液滴在制備過(guò)程中獲得過(guò)多的能量，可能需要一定時(shí)間達(dá)到熱力學(xué)平衡[21]。由于奧斯特瓦爾德熟化等作用，小液滴向大液滴靠攏并發(fā)生聚集，粒徑逐漸上升[22-23]。

2.5 乳化指數(shù)測(cè)定

乳化指數(shù)是表征乳液穩(wěn)定性的方法，高乳化指數(shù)表明乳液由于粒徑大、共軛、絮凝或聚集造成乳液不穩(wěn)定。如圖3所示，當(dāng)精油添加量為1%和3%時(shí)，在4、25、40 ℃下28 d的儲(chǔ)存期間內(nèi)沒(méi)有產(chǎn)生乳化層，說(shuō)明乳液的穩(wěn)定性良好，且一定范圍內(nèi)溫度對(duì)乳液的穩(wěn)定性無(wú)顯著影響。當(dāng)精油添加量增加至6%和10%時(shí)，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加乳化指數(shù)有所增加。且溫度越高，乳液的乳化指數(shù)增長(zhǎng)越大，表明乳液的加工貯藏中溫度依然對(duì)其穩(wěn)定性有一定影響。

2.6 熒光顯微鏡

新鮮納米乳液和25 ℃下儲(chǔ)存28 d后納米乳液的熒光顯微鏡圖如圖4～圖5所示。新鮮制備的納米乳液呈現(xiàn)出非常微小且均勻分布的油滴，但仍能觀察到隨著精油添加量的增加，精油的分布更加密集，并且液滴大小有一定的增長(zhǎng)，這與表2中的數(shù)據(jù)相符。對(duì)比新鮮乳液和儲(chǔ)存28 d的熒光圖，肉眼可見的乳液油滴粒徑有明顯的增長(zhǎng)，這與儲(chǔ)藏過(guò)程粒徑的變化趨勢(shì)相一致。但從圖5中可見，乳液中油滴仍然是分布相對(duì)均勻的，包括肉桂精油體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，表明1%酪蛋白酸鈉和3%HPCD共同乳化的肉桂精油納米乳液具備良好的穩(wěn)定性。

注：a:1.0SC+3HPCD+1CEO;b:1.0SC+3HPCD+3CEO;c:1.0SC+3HPCD+6CEO;d:1.0SC+3HPCD+10CEO,下同。圖4 新鮮乳液熒光顯微圖

圖5 25 ℃下儲(chǔ)存28 d乳液熒光顯微圖

3 結(jié)論

與單獨(dú)使用酪蛋白酸鈉穩(wěn)定的乳液相比，HPCD與酪蛋白酸鈉共同穩(wěn)定的乳液具備更低的粒徑及PDI值；1%酪蛋白酸鈉和3%HPCD共同穩(wěn)定的肉桂精油納米乳液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出良好的抗菌作用，以及相比精油自身更低的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。乳液在4、25、40 ℃下儲(chǔ)存過(guò)程中的粒徑、乳化指數(shù)、以及熒光顯微鏡圖均表明1%酪蛋白酸鈉和3%HPCD共同乳化的肉桂精油納米乳液具備良好的穩(wěn)定性。HPCD 具有親脂的內(nèi)部空間和親水的外部基團(tuán)，水不溶性的精油可以進(jìn)入親脂的內(nèi)部空間，與HPCD 形成水溶性復(fù)合體，從而起到抑制精油的聚集，輔助其他乳化劑降低乳液粒徑，增強(qiáng)乳液穩(wěn)定性的效果。