Box-Behnken響應面優化大豆7S球蛋白含促溶劑的反膠束提取工藝

孫 雪 趙曉燕 張曉偉 劉紅開 朱運平

(濟南大學烹飪學院食品科學與營養系1, 濟南 250022) (北京工商大學北京市食品添加劑工程技術研究中心2, 北京 102488)

大豆分離蛋白富含多種人體所需的必需氨基酸[1]，與雞蛋白同屬于優質蛋白，因此在食品加工領域應用廣泛[2]。大豆分離蛋白作為植物中優質蛋白的代表,不僅營養價值高，而且具有良好的功能特性[3]。大豆分離蛋白根據沉降系數可分為2S、7S、11S和15S球蛋白[4]，其中7S球蛋白的含量約占總大豆分離蛋白的30%左右[5]，所以7S球蛋白與大豆分離蛋白的功能特性有密不可分的關系。

反膠束提取法作為一種新興的蛋白萃取方法[6]，與傳統的堿提酸沉法和等電點沉淀法想比，所提取的蛋白具有良好的功能特性及穩定的空間結構[7]，因此具有廣闊的發展前景。目前，反膠束已經成為最有吸引力和前景的蛋白質提取方法之一[8]，但反膠束體系提取的蛋白存在提取率低、成本高等缺點，因此難以應用到實際的工業生產[9]。

反膠束提取蛋白的過程包括前萃取和后萃取這兩個過程。在以往反膠束萃取蛋白的研究中，對促溶劑的研究較少。目前，主要有關于反萃取添加促溶劑的研究，常用的反萃取促溶劑有尿素和鹽酸胍等[10]，但尿素和鹽酸胍屬于蛋白常用的變性劑，因此會對蛋白質天然結構造成一定的破壞。另外，反萃取的提取率通常要遠遠高于前萃取率，因此提高前萃取率是提高反膠束最終提取率的關鍵。蔗糖屬于天然可提取的二糖，而三氯蔗糖是其氯化衍生物。盡管蔗糖和三氯蔗糖具有相似的化學結構，但是它們對蛋白質的作用卻有很大差異[11]。蔗糖可以穩定蛋白質的天然結構，而三氯蔗糖則會破壞蛋白質的天然結構[12]。此外，蔗糖和三氯蔗糖是大量水和動力學的有效還原劑[12]。這為提高反膠束的萃取率提供了思路。

在本研究中選取了蔗糖和三氯蔗糖作為促溶劑，通過單因素試驗，結合Box-Behnken響應面進行優化試驗設計，研究了不同種類和濃度的促溶劑對反膠束萃取7S球蛋白萃取率的影響。本研究將會有助于進一步提高反膠束萃取蛋白的提取率，對反膠束技術實現工業化生產具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

該大豆是由山東省農科院作物研究所提供的非轉基因大豆新品種(齊黃34)，蛋白質質量分數為42.77%，脂肪為21.26%。大豆經粉碎機粉碎后，過100目篩，再經正己烷脫脂后獲得脫脂大豆粉。

比辛可寧酸(BCA)蛋白測定試劑盒、雙(2-乙基己基)磺基琥珀酸鈉(AOT)、正己烷、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、亞硫酸氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸、乙醇、冰醋酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、甘氨酸、2-巰基乙醇(2-Me)、考馬斯亮藍。

1.2 儀器與設備

TGL16M臺式高速冷凍離心機，FD-1A-50冷凍干燥機，OSI-SDL恒溫水浴震蕩器，UPT-I-10T超純水機，UV756紫外可見光分光光度計，ZSD-2自動水分滴定儀，AE-6500電泳儀，6202小型高速研磨機，pH酸度計，KQ3200DB型數控超聲波清洗器。

1.3 方法

1.3.1 等電點沉淀法提取大豆7S球蛋白

參照NAGANO[13]等方法提取大豆7S球蛋白，略有改動。稱取12 g的脫脂大豆粉放入三角錐形瓶中，加入500 mL(pH 8.0)超純水，在45 ℃恒溫水浴中，250 r/min以上的速度震蕩2 h，然后在8 000r/min的條件下離心20 min，取上清液。上清液中添加NaHSO3，使濃度為0.01 mol/L，然后用2 mol/L的HCl調pH至6.4，4 ℃下貯藏過夜，然后離心(12 000×g，20 min，4 ℃)。所得上清液加NaCl調離子濃度至0.08 mol/L，用2 mol/L的HCL調pH至5.4，離心(9 000×g，30 min，4 ℃)，上清液加入等體積冰水，用2 mol/L的HCl調pH至4.8，離心(12 000×g，20 min，4 ℃)。沉淀水洗2次后用超純水溶解，調pH至7.5，4 ℃下透析24 h，冷凍干燥后得大豆7S球蛋白。

1.3.2 反膠束萃取法提取大豆7S球蛋白

參照ZHAO[14]等方法，略有改動。稱取一定質量的AOT于錐形瓶中，加入一定體積的正己烷，配制成0.08 g/mL的溶液，使表面活性劑完全溶解，取20 mL的AOT反膠束體系進行試驗，加入濃度為0.05 mol/L的電解質緩沖溶液，超聲15 min后靜置澄清，溶液透明后加入等電點沉淀法提取的大豆7S球蛋白粉，在恒溫水浴中，250 r/min的速度震蕩，然后在4 800 r/min的條件下離心15 min，取上層前萃液，采用BCA蛋白濃度測定法[15]檢測前萃液中蛋白質含量，計算蛋白前萃率。

前萃液加入等體積的電解質(KCl)緩沖液(KH2PO4-Na2HPO4)，在恒溫水浴中，250 r/min的速度震蕩，然后在4 800 r/min的條件下離心15 min，取下層后萃液，采用BCA蛋白濃度測定法[15]檢測后萃液中蛋白質含量，計算蛋白后萃率。后萃液在4 ℃下透析24 h，冷凍干燥得純化后的7S球蛋白。

1.3.3 反膠束提取7S球蛋白的前萃和后萃單因素試驗設計

前萃試驗中選取蔗糖和三氯蔗糖及其濃度(0～2 mol/L)、W0(0～30)、緩沖液pH (2～13)、電解質濃度(0～0.4 mol/L)、萃取溫度(30～60 ℃)、萃取時間(10～60 min)、固液比為(0.5～5 g/L)作為前萃取單因素用于進一步試驗。

在后萃試驗中選取電解質濃度(0～1.6mol/L)、緩沖液pH(3～13)、萃取溫度(30～60 ℃)及萃取時間(10～60 min)作為反萃取單因素用于進一步試驗。

1.3.4 反膠束提取大豆7S球蛋白的響應面試驗設計

在前萃單因素試驗基礎上，前萃選擇蔗糖濃度(A)、電解質濃度(B)、pH(C)三個因素，以大豆7S球蛋白前萃率(Y)為指標；在后萃單因素試驗基礎上，后萃選擇電解質濃度(A)、pH(B)、后萃溫度(C)三個因素，以大豆7S球蛋白后萃率(Y)為指標，采用Box-Behnken設計進行試驗，以-1、0、1編碼自變量低、中、高水平，因素水平編碼見表1與表2。

表1 前萃Box-Behnken試驗設計

表2 后萃Box-Behnken試驗設計

1.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(SDS-PAGE)

將蛋白粉末溶于超純水中配制成質量濃度為2 mg/mL的蛋白溶液，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳具體操作參照文獻[16]。

2 結果與分析

2.1 促溶劑的種類和含量對大豆7S蛋白前萃提取率的影響

圖1顯示了蔗糖和三氯蔗糖濃度對反膠束正向提取速率的影響。如圖1所示，添加蔗糖和三氯蔗糖的反膠束前萃率可以分別從37.19%提高到78.82%和69.90%。這表明促溶劑的添加可以顯著提高反膠束體系提取7S球蛋白的前萃率，并且蔗糖的促進效果較三氯蔗糖更好。

蔗糖和三氯蔗糖對大豆7S球蛋白前萃率的促進作用，可能是因為添加的蔗糖和三氯蔗糖分子存在于反膠束的水池以及界面區域，較大尺寸的蔗糖和三氯蔗糖分子從反膠束的界面置換了較小的水分子，并在界面區域與AOT的磺酸鹽基團形成了更強的分子間氫鍵，導致反膠束的水池尺寸增大[17]。此外，蔗糖分子與水之間的氫鍵相互作用比水分子本身之間的氫鍵相互作用更強，導致反膠束整體的微黏度增加[18]，增加了蛋白質的溶解度。對于三氯蔗糖，由于三氯蔗糖中存在較少的-OH基團(因為此處三個-OH基團被相對較大尺寸的氯原子取代)，疏水性或氫鍵鍵合效率的程度較小，這可能也是導致三氯蔗糖的促進效果低于蔗糖的一個原因[19,20]。蔗糖作為一種天然的甜味劑[21]，與三氯蔗糖相比不僅更加安全而且價格更加廉價，并且加入少量的蔗糖就可以達到顯著提高萃取率的效果，這為反膠束技術實現工業化生產提供了理論依據。

圖1 不同濃度蔗糖和三氯蔗糖對反膠束提取7S球蛋白提取率的影響

2.2 響應面結果與分析

2.2.1 反膠束萃取大豆7S球蛋白的前萃響應面試驗結果與分析

如表3所示，Box-Behnken試驗進行了17次運行，以優化三個單獨的提取參數。采用響應面軟件Design Expert 10.0對表3試驗數據進行多元回歸擬合，得到的分析結果見表4。經回歸擬合后，建立多元二次響應面回歸模型：Y=72.43-1.71A+1.63B+1.65C+0.58AB-2.06AC+0.26BC+2.00A2+2.90B2-2.76C2

由表4可知，R2=0.981 4，模型P<0.001，說明模型具有極顯著性。且失擬項P>0.05，失擬項不顯著，說明二次多項回歸方程擬合程度良好，具有統計學意義。

F值與響應值的影響成正比，F值越大對響應值的影響越大[22]，因此，各因素對7S球蛋白前萃提取率的影響排序依次為蔗糖濃度>pH>電解質濃度，且蔗糖濃度該因素的P<0.05，這也證明與其他影響蛋白前萃率的因素相比，蔗糖濃度對蛋白前萃率影響最為顯著。由表4各交互因素的F值和P值大小可以發現，蔗糖濃度與電解質濃度(AB)的F值較小，且P>0.05，表明交互作用對7S球蛋白前萃提取率的影響較小；蔗糖濃度和pH(AC)F值較大，且P<0.05，說明其交互作用對7S球蛋白前萃提取率的影響顯著；電解質濃度與pH(BC)的P>0.05，但F值較AB交互作用更大，說明BC交互作用對7S球蛋白前萃提取率的影響較AB更大。

表3 前萃響應面試驗設計和結果

表4 回歸方程的方差分析表

通過Design-Expert軟件響應面進行分析，得到以下最佳前萃條件：蔗糖濃度0.04 mol/L、電解質濃度0.2 mol/L、pH為8.719。在最佳條件下，7S球蛋白最大預測前萃率為83.301%。考慮到萃取過程的實際操作，優化條件為：蔗糖濃度0.04 mol/L、電解質濃度0.2 mol/L、pH為8.7，在此條件下進行3次平行驗證試驗。結果表明，實際試驗前萃率為83.21%，與預測產量無顯著差異，說明此回歸模型與實際情況具有良好的擬合性，所建模型準確，可靠且具有實用價值。

對比關于AOT反膠束提取植物蛋白的研究發現：HE[23]等提取的菜豆凝集素，劉遠海[24]等提取的大豆蛋白，王憲昌[25]等萃取的核桃粕蛋白的前萃率分別為 53.28%、65.37%和68.7%；本試驗提取的大豆7S球蛋白前萃率達到了83.21%，證明促溶劑可以顯著提高AOT反膠束體系提取蛋白的前萃率。

2.2.2 反膠束萃取大豆7S球蛋白的后萃響應面結果與分析

如表5所示，Box-Behnken試驗進行了17次運行，以優化三個單獨的提取參數。采用響應面軟件Design Expert 10.0對表5試驗數據進行多元回歸擬合，得到的分析結果見表6。經回歸擬合后，建立多元二次響應面回歸模型：

Y=77.03+1.46A+9.06B-0.30C-3.41AB+0.38AC+0.57BC+1.70A2+1.75B2-2.96C2

表5 后萃響應面試驗設計和結果

由表6可知，R2=0.993 6，模型P<0.001，說明模型具有極顯著性。且失擬項P>0.05，失擬項不顯著，說明二次多項回歸方程擬合程度良好，具有統計學意義。

表6 回歸方程的方差分析表

由F值和P值可知，各因素對后萃率的影響排序依次為pH>電解質濃度>溫度。由表6各交互因素的F值、P值的大小可以發現，pH和電解質濃度(AB)相比于其他兩種交互作用的F值最大，且P<0.001，說明其交互作用對7S球蛋白后萃提取率的影響極顯著；電解質濃度與溫度(AC)的F值較小，且P>0.05，表明交互作用對7S球蛋白后萃提取率的影響較小；pH與溫度(BC)的P>0.05，但F值較AC交互作用更大，說明BC交互作用對7S球蛋白后萃提取率的影響較AC更大。

通過Design-Expert軟件響應面進行分析，得到以下最佳萃取條件：電解質濃度0.8 mol/L、pH為12、溫度54.908 ℃。在最佳條件下，7S球蛋白最大預測后萃率為91.499%。考慮到萃取過程的實際操作，優化條件為：電解質濃度0.8 mol/L、pH為12、溫度55 ℃，在此條件下進行3次平行驗證試驗。結果表明，實際試驗后萃率為90.5%，與預測產量無顯著差異，說明此回歸模型與實際情況具有良好的擬合性，所建模型準確，可靠且具有實用價值。

2.3 SDS-PAGE分析

圖2顯示了等電點沉淀法與反膠束萃取法所制備的大豆7S球蛋白的SDS-PAGE結果。大豆7S球蛋白由α`(58 ku)亞基、α(57 ku)亞基和β(42 ku)三個亞基組成。從電泳條帶可以看出兩種方法分離的蛋白條帶對應的分子量與大豆7S球蛋白組分吻合[26]，因此可以確定兩種方法得到的蛋白樣品的確是大豆7S球蛋白這一組分。通過圖2可以發現等電點沉淀法制備的7S球蛋白α亞基(66.2～45.0 ku之間)存在部分解離現象，條帶減弱分解成分子量較小的條帶，而反膠束制備的7S球蛋白不存在這一現象。這可能是因為等電點處理的酸堿環境在一定程度上誘導了7S球蛋白的解折疊[27]，從而導致α亞基出現部分解離。而蔗糖具有在不利條件下維持蛋白質正常結構的獨特能力[28]，因此含蔗糖的反膠束處理使等電點提取的7S球蛋白的折疊結構得到了恢復。運用Quantity One分析軟件對圖2電泳圖進行純度分析，結果表明等電點沉淀法提取的大豆7S球蛋白的純度為92.01%，經反膠束純化后的大豆7S球蛋白的純度達到了96.17%。這說明含蔗糖的反膠束不僅可以進一步提高等電點提取的7S球蛋白的純度，而且還能使蛋白分子的亞基折疊結構得到恢復。

注：M為標準蛋白，1、2分別為等電點7S球蛋白，3、4分別為反膠束7S球蛋白，5、6分別為大豆分離蛋白。圖2 大豆7S球蛋白和大豆分離蛋白電泳圖

3 結論

本研究選取了蔗糖和三氯蔗糖作為反膠束提取大豆7S球蛋白的促溶劑，研究了不同種類的促溶劑及含量對反膠束萃取大豆7S球蛋白提取率的影響。研究發現，蔗糖較三氯蔗糖的促進效果更好，與未加入促溶劑的反膠束體系相比，加入促溶劑的反膠束體系的前萃率最高增加了35.6%。經過單因素試驗與響應面優化實驗設計，發現蔗糖濃度較其他提取因素對前萃率的影響最大，這也證明了促溶劑的研究對提高反膠束蛋白萃取率具有重要意義。

反膠束提取大豆7S球蛋白的最佳前萃和后萃條件為：在蔗糖濃度0.04 mol/L、W0為22、pH為8.7、電解質濃度0.2 mol/L、萃取溫度55 ℃、萃取時間50 min、固液比為1.5 g/L的條件下，蛋白前萃率為83.21%；在電解質濃度0.8 mol/L、pH為12、萃取溫度55 ℃、萃取時間20 min的條件下，蛋白后萃率為90.5%。最終蛋白總萃取率為75.31%。經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，含蔗糖的反膠束不僅可以進一步提高等電點提取的7S球蛋白的純度，而且還能使蛋白分子的亞基折疊結構得到恢復。