3種藜麥皂苷的超聲提取及抗氧化活性比較

傅 鈺 張 禾 符 群,2

(東北林業大學林學院1，哈爾濱 150040) (黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室2，哈爾濱 150040)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)是藜科藜屬植物，具有一定的耐旱、耐寒、耐鹽性，根據其種皮的顏色不同可分為白、紅、黑3種。藜麥中富含多種氨基酸、維生素、多酚類[1，2]、黃酮類、皂苷和植物甾醇類物質，其所含脂肪中不飽和脂肪酸占83%[3]，具有多種健康功效，可以抗腫瘤[4，5]、抑菌、抗病毒[6，7]、抗氧化等[8，9]。藜麥在1980年被美國宇航局用于宇航員的太空食品。聯合國糧農組織認為藜麥是唯一一種單體植物且可滿足人體基本營養需求，正式推薦藜麥為最適宜人類的全營養食品，因此藜麥也被國際營養學家稱為“未來食品”“超級谷物”[10]。皂苷又稱為皂角苷，研究發現皂苷具有多種生理功效，如抑菌、降低膽固醇水平等，多種中藥的有效成分都為皂苷。藜麥麩皮中含有大量皂苷，質量分數可達20%～30%[7]。藜麥皂苷水溶后會產生苦澀味，過高劑量服用會產生毒性，但由于其優良特性，近年來成為醫學、食品等行業的熱點研究對象[11]。

目前，活性成分的提取方法以有機溶劑浸提為主，微波、超聲波等技術作為輔助提取。由于植物活性物質具有多元酚羥基和一定的極性，因此在藜麥皂苷的提取中常選用水或乙醇、甲醇、丙酮等有機溶液作為提取劑，這一類溶劑具有較好的溶解性能，并且對植物細胞具有一定的穿透能力，可以促進物質的分離。有機溶劑萃取法成本低廉，設備結構簡單，但提取效率往往比較低[12]。超聲波輔助提取是利用超聲波產生的空化效應，使原料的微小顆粒發生收縮和崩裂，從而釋放出活性成分[13]。已有研究對不同顏色的藜麥之間的對比較少，且藜麥制品的原料選擇也鮮有關注。趙丹青等[14]對不同品種藜麥的主要營養成分和礦物元素含量進行分析，得到在不同顏色藜麥中，黑色藜麥中各類氨基酸含量均高于其他顏色的藜麥。因此本實驗通過超聲波輔助乙醇提取法[15]，在單因素實驗的基礎上, 運用響應面優化設計實驗對藜麥中的皂苷提取工藝進行優化, 確定最佳提取條件，并對3種藜麥中提取的皂苷進行抗氧化劑效實驗, 為提取和評價藜麥中活性成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑、紅、白藜麥：2018年采集自青海省西寧市多巴鎮。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(≥98%)，2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)銨鹽，齊墩果酸(≥98%)；冰乙酸、無水乙醇、香草醛、鐵氰化鉀、三氯化鐵、過硫酸鉀等均為分析純。

T6紫外可見分光光度計，KQ-300DE數控超聲清洗器，EPOCH2全波長酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 原料處理

3種藜麥挑選去雜，低溫干燥至水分恒定，破碎為60目粉末，冷藏備用。以黑色藜麥為例，研究藜麥皂苷的提取工藝。

1.2.2 齊墩果酸標準曲線繪制與皂苷含量測定

準確稱量25 mg齊墩果酸標準品，用乙醇配制成1 mg/mL的母液。分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL母液于7個10 mL試管中，置于70 ℃水浴揮干溶劑。再加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，在60 ℃水浴下反應15 min，取出后用冷水冷卻，加入5.00 mL冰醋酸并在暗處反應15 min。以無標準品的空白樣為對照，在550 nm處測定吸光值，以齊墩果酸質量濃度(mg/mL)為橫坐標(X)，吸光值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線[16]。得到線性回歸方程：Y=1.516 67X+0.016 67，R2=0.999 7。

對提取液按照該方法測定皂苷含量，將測得的吸光度值代入回歸方程中得到皂苷濃度，并按照式(1)計算提取液中皂苷提取量。

(1)

式中：c為提取液中皂苷的濃度/mg/mL；V為提取液定容體積/mL；M為藜麥粉質量/g。

1.2.3 超聲波輔助乙醇提取藜麥皂苷的工藝研究

準確稱取1.000 g黑藜麥粉，以黑色藜麥中皂苷提取量為評價指標進行單因素實驗，在300 W超聲功率下，分別考察液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g)，提取時間(20、30、40、50、60 min)，提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)，乙醇體積分數(50%、60%、70%、80%、90%、100%)對皂苷提取量的影響。

根據單因素實驗結果，采取Box-Behnken實驗設計方法，利用Design-Expert設計四因素三水平的響應面工藝優化實驗，對超聲波輔助提取藜麥中皂苷的工藝參數進行優化。

1.2.4 藜麥提取物的抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH·自由基清除率測定

在96孔板中依次加入不同濃度梯度的樣液100 μL和0.2 mol/L DPPH·溶液100 μL，充分混勻，避光反應30 min后于517 nm波長下測定吸光值Ai。用100 μL無水乙醇代替DPPH·溶液，測定吸光度值Aj。用100 μL無水乙醇代替不同濃度梯度的皂苷提取液，測定吸光度值A0。根據式(2)計算活性物質對DPPH·清除率[17]。

(2)

式中：Ai為樣品液的吸光度值；Aj為樣品空白管的吸光度值；A0為空白對照管的吸光度值。

1.2.4.2 ABTS+·自由基清除率測定

將7.4 mmol/LABTS+·溶液與2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液按體積比1∶1混合，室溫避光靜置12～16 h，用乙醇稀釋至在734 nm處吸光度值為0.7±0.02，備用。在96孔板中依次加入25 μL不同濃度梯度的皂苷提取液，200 μL ABTS+·溶液，避光靜置6 min，在734 nm處測吸光度值，得到A1。用25 μL乙醇代替樣液，測定吸光度值，得到A0。用200 μL乙醇代替ABTS+·溶液，測定吸光度值，得到A2。根據式(3)計算活性物質對ABTS+·清除率[17]。

(3)

式中：A0為空白對照吸光度值；A1為樣液吸光度值；A2為樣液空白管吸光度值。

1.2.4.3 總還原力的測定

取不同濃度梯度的皂苷溶液0.1 mL于試管中，并加入1.00 mL抗壞血酸、2.5 mL磷酸鹽緩沖液和鐵氰化鉀溶液，將試管置于50 ℃水浴中反應20 min，取出后迅速冷卻至室溫，再加入2.5 mL三氯乙酸。將混合溶液轉移至離心管中，在4 000 r/min的條件下離心10 min。取上清液2.5 mL于試管中，加入2.5 mL蒸餾水和1.00 mL三氯化鐵，混合均勻后，在700 nm下測量溶液的吸光值，以無水乙醇調零[18]。

2 結果與分析

2.1 提取單因素實驗結果及分析

由圖1可見，隨著液料比、提取時間、提取溫度、乙醇體積分數的增加，皂苷提取量總體呈先上升后下降的趨勢，其中乙醇體積分數對皂苷提取量的影響最為顯著。這可能是由于隨著液料比和提取時間的增加，固體原料與溶液的接觸面積增加且反應時間加長，使皂苷更充分地溶解于乙醇溶液中，但當液料比增大到一定比例后，其對接觸面積的影響將不再明顯，且時間繼續增加可能會融入其他的雜質干擾了皂苷的溶出，并且破壞皂苷成分，從而使皂苷的提取量下降；提取溫度升高會使分子的擴散速度快，皂苷分子溶解在乙醇溶液中的能力變強，當溫度過高時，可能會引起溶劑的揮發過大，并且伴隨著較多雜質物質的溶出，從而導致皂苷提取量的下降；而體積分數的增加，乙醇提取液的極性與被提取溶質的極性逐漸接近，根據相似相溶的原理，更多的皂苷溶解在乙醇提取液中，但當體積分數增大到100%時被提取溶質的極性會小于提取液的極性，且其他雜質的溶出量會增加，從而導致了藜麥皂苷提取量的減小。

圖1 不同單因素對皂苷提取量的影響

2.2 響應面實驗結果及分析

2.2.1 響應面結果與方差分析

根據單因素的實驗結果，以黑色藜麥中皂苷提取量為響應值，以提取時間、提取溫度、液料比、乙醇體積分數為自變量，進行四因素三水平的響應面分析實驗，經 Design-Expert 8.0.6 trial 設計的實驗方案及結果如表1所示。

表1 響應面設計實驗結果

表2 方差分析表

2.2.2 響應曲面與等高線分析

藜麥皂苷提取量的影響因素及其交互作用的顯著性如圖2～圖7所示。通過等高線的形狀分析交互影響的顯著程，響應面上標記的最高點即為最大值，說明在所選分析的因素水平范圍內存在極值[19]。由圖2～圖7可知，提取時間、提取溫度、液料比和體積分數對皂苷提取量均有顯著影響。圖2表明當溫度一定時，隨著提取時間的增加，皂苷的提取量增大，當提取時間達到50 min時提取量最高，繼續增加提取時間其提取量會發生下降；當提取時間一定時，提取溫度有相同的趨勢，但影響較小；隨著提取溫度的增大，皂苷的提取量先增大后減小。圖3和圖4表示隨著乙醇體積分數的增大，藜麥皂苷的提取量先增大后減小，在90%時取得最大值；液料比和提取時間對提取量均有相同的影響趨勢，但效果小于體積分數。圖5表明當液料比一定時，提取溫度增大會使皂苷的提取量先增大后減小，在60 ℃時達到最大值；溫度一定時，液料比對提取量有相同的影響趨勢。圖6表明體積分數和提取溫度的增大都會使皂苷提取量先增大后減小，分別在90%和60 ℃時取得最高點。圖7表明體積分數和液料比對皂苷的提取量影響效果相同，提取量隨著體積分數和液料比的增大而先升高后下降，在90%和50∶1 mL/g時達最大值。

圖2 提取時間及提取溫度對皂苷提取量的等高線及響應面

圖3 提取時間及液料比對皂苷提取量的等高線及響應面

圖4 提取時間及乙醇體積分數對皂苷提取量的等高線及響應面

圖5 提取溫度及液料比對皂苷提取量的等高線及響應面

圖6 提取溫度及乙醇體積分數對皂苷提取量的等高線及響應面

圖7 液料比及乙醇體積分數對皂苷提取量的等高線及響應面

2.2.3 最佳條件確定和回歸模型驗證實驗結果

通過響應面分析得到超聲波輔助乙醇提取藜麥中皂苷的最佳工藝條件為：提取時間51.29 min，提取溫度59.74 ℃，液料比50.02∶1 mL/g，乙醇體積分數90.57%，在此條件下皂苷提取量為12.717 5 mg/g。為使實際操作中更便于控制，調整最佳工藝為：提取時間50 min，提取溫度60 ℃，液料比50∶1 mL/g，乙醇體積分數90%。在此條件下進行最優工藝的驗證，計算出皂苷提取量為12.65 mg/g，實際得率與模型預測值的誤差為0.5%，證明模型理論預測值與實際值擬合效果良好。

采用相同方法對白色、紅色藜麥皂苷提取工藝進行研究，因素優化后的水平結果與黑色藜麥無顯著差異。

2.2.4 3種不同顏色的藜麥的抗氧化能力評價

2.2.4.1 DPPH·自由基清除能力

黑、白、紅3種顏色藜麥中的皂苷對DPPH· 的清除能力如圖8。隨著3種藜麥皂苷濃度增加，其清除DPPH·自由基的能力均呈現顯著增加趨勢，當濃度達到10 mg/g時，3種藜麥的清除能力集中在較小的范圍內；當濃度較低時，3種不同品種的藜麥在其相同皂苷濃度條件下對DPPH·自由基的清除能力差異較大。黑色、紅色、白色藜麥皂苷的IC50分別為2.205、3.724、4.303 mg/g。總體趨勢表現為黑色藜麥>紅色藜麥>白色藜麥，即隨著其種皮顏色的由深至淺，抗氧化能力逐漸減弱。這可能是由于不同顏色的藜麥中含有的有效抗氧化皂苷量差異較大，其中深色藜麥含有較多且活性高，導致抗氧化能力更強。

圖8 不同藜麥皂苷對DPPH·自由基清除的影響

2.2.4.2 ABTS+·自由基清除能力

黑、白、紅3種顏色藜麥中的皂苷對ABTS+·清除能力結果如圖9。隨著皂苷濃度的增加，藜麥皂苷對ABTS+·自由基的清除能力也在逐漸增強。當皂苷濃度達到10 mg/g時，黑、紅、白三色藜麥皂苷清除率差異顯著(P<0.05)，說明不同品種的藜麥中皂苷種類可能有所不同，因此在清除ABTS+·自由基時表現出了不同的能力大小。在皂苷濃度較低時，紅色和白色藜麥清除能力相近，仍顯著小于黑色藜麥。3個品種的藜麥對ABTS+·自由基的清除能力大小為：黑色藜麥>紅色藜麥>白色藜麥。

圖9 不同藜麥皂苷對ABTS+·自由基清除的影響

2.2.4.3 總還原力

黑、白、紅3種顏色藜麥中的皂苷總還原能力對比結果見圖10。總還原力的強弱與吸光值的大小成正比。由圖10可知，3個不同品種藜麥皂苷的總還原力隨著皂苷濃度的增大而逐漸增強，其中黑色藜麥的還原能力極顯著大于紅色藜麥和白色藜麥(P<0.01)，而白色藜麥略大于紅色藜麥。已有研究證明，皂苷類化合物的抗氧化活性與皂苷元配基的結構和糖殘基的數量有關[20]，因此可能是由于黑色藜麥與其他兩色的糖基不同導致活性差異顯著。

圖10 不同藜麥皂苷總還原能力對比

3 結論

采用超聲波輔助乙醇提取藜麥中皂苷化合物，單因素實驗結果表明，4個因素對皂苷的提取量影響趨勢相似，即先增大后減小。通過響應面優化出最佳工藝為：乙醇體積分數90%，液料比為50∶1 mL/g，超聲功率300 W，提取溫度60 ℃，提取時間50 min，此時皂苷的提取量為12.65 mg/g，結合響應面實驗可得出4個因素對提取量的影響顯著程度為：提取時間>體積分數>提取溫度>液料比。

對比了黑、紅、白3種藜麥皂苷的抗氧化能力強弱，結果表明，在對DPPH·、ABTS+·自由基的清除能力方面表現為：黑色藜麥>紅色藜麥>白色藜麥；在總還原能力方面表現為：黑色藜麥>白色藜麥>紅色藜麥。藜麥皂苷具有良好的抗氧化能力，且由于品種的不同其抗氧化能力也有所差異，整體上表現為深色藜麥皂苷活性優于淺色藜麥皂苷，其中黑色藜麥的抗氧化能力最強。本研究體現出顯著的皂苷與抗氧化活性間劑量-效應關系。藜麥提取物為混合物，今后研究可對提取物的成分進行鑒定，以充分確證和評價藜麥皂苷活性。

不同顏色的藜麥之間存在一定程度的品質差異，在口感方面，淺色藜麥優于深色藜麥；但在抗氧化能力方面，黑色藜麥的抗氧化能力顯著高于紅色和白色藜麥。因此，在食品加工生產中可根據不同產品需求選擇不同顏色的藜麥原料。