利用二倍體資源選育油炸加工馬鈴薯品種

馬子竣，孫繼英，劉玲玲，汝甲榮，王懷鵬，牛若超

（黑龍江省農業科學院克山分院，黑龍江 克山161606）

馬鈴薯塊莖營養豐富、單位面積產量高，在中國已成為第四大主糧作物，在總產和總播種面積上已經多年位居全球首位。由于消費方式的變化和生活水平的提高，馬鈴薯炸條、炸片加工產品消費量逐年攀升。國內自主育成的加工型馬鈴薯品種利用有限，國外引進品種一直占據主導地位。在品種方面，‘Atlantic’、‘Russet Burbank’、‘Shepody’和‘Innovator’一直占據著較大的市場份額。國內市場對馬鈴薯深加工產品需求量擴大，但是專用馬鈴薯供應卻不足[1]，隨著馬鈴薯主糧化工程的持續推進，這一矛盾必將進一步突顯[2]。而且隨著“世界貿易一體化”推進，國際間知識產權保護意識加強，國內種薯繁育單位在非授權下種植經營國外這些品種所面臨的經濟風險逐漸加劇。如何加快育成優質、多抗、適宜深加工、豐產性好的自主馬鈴薯加工型品種，一直困擾著馬鈴薯育種家。當前，中國馬鈴薯育種主要是在普通栽培種內雜交，研究證實馬鈴薯育種在四倍體水平雜交加工品質很難有所突破[3]，通過4x×2x種間雜交可以顯著提高后代的比重[4,5]。

1 馬鈴薯加工品種的育種目標

作物育種首先需要按照預期市場需求制定好長期的育種目標，在配制組合后對分離后代進行有方向的選擇和有計劃地改良。油炸加工型馬鈴薯的育種目標，首先要滿足抗性的需求和對光照的適應性，并且具有較高的產量，然后還要滿足加工方面的特殊需要。薯皮薄且光滑，表面芽眼要淺而少，這樣有利于機械清洗去皮；較低的還原糖含量，一般要求低于0.4%（鮮重），高于0.1%（鮮重）最好，以防止發生美拉德反應產生褐化[6]；抗低溫糖化，在低溫貯藏后還原糖含量仍然較低，可直接用于加工免除常溫出庫升溫回暖環節[7]；髓部要小，由于髓部富集更多的天冬酰胺和還原糖，易產生美拉德反應，油炸也更易產生丙烯酰胺類有毒物質[8]；炸條型品種薯形上要求其為長筒形或長橢圓形，且具有一定的長度；炸片品種在薯形上要求圓球形或者細圓柱形，直徑不宜過大，一致性要好；要求無畸形和二次生長；薯皮不宜綠化；薯肉顏色以白色為佳，淡乳黃色亦可接受；食味品質要無異味雜味，炸條要求薯香味濃郁。

在制成品的品質上，炸片型要求酥脆；炸條型要求薯肉挺實起砂，不易彎曲或塌陷變形，這個性狀與其干物質含量和相對密度有關；較好的加工品質需要較高干物質含量作為支持，馬鈴薯塊莖的干物質含量一般用水比重法快速測定[9]。

2 遺傳異質性對馬鈴薯產量的影響

Mondoza和Haynes[10]曾提出馬鈴薯品種或品系的產量公式X=f（A+R+Y）

式中：A代表光溫適應性基因，R代表抗性基因，Y代表產量相關基因。其中的Y代表多基因控制的光能利用率、光能向化學能轉化的轉化效率等產量有關基因。在A與環境相適宜且R基因抗逆性較好的前提下，從遺傳學角度分析產量潛力與遺傳異質性相關，一個位點的多個等位基因若產生變異，并且位點內等位基因的變異引起一些位點內的互作效應，一定范圍內此類互作效應與雜種優勢正相關[11,12]。由此可見，在保證品種的適應前提下，從遺傳基因層面提高其抗性、增加其遺傳異質性、增強等位基因間互作效應是提高產量的有效途徑。

3 國內普通栽培種遺傳基礎狹窄

3.1 歷史成因

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）一年生草本，原產于南美洲的安第斯山脈，在其起源中心分布著多種倍性的野生資源種[13]。生產上廣泛種植的馬鈴薯（S.tuberosumssp.tuberosum）是四倍體（2n=4x=48）作物[13]。最早為探險家在南美發現土著居民栽培作為食物，遂被引入歐洲種植，其后于明代萬歷年間傳入中國[14]。在此過程中經過長日照選擇，19世紀的晚疫病大流行的毀滅，導致馬鈴薯遺傳基礎變得狹窄。中國有序的科研育種工作開始于20世紀40年代，以引進鑒定泊來品種和篩選國外配制組合的實生后代為主[15]，由于光照選擇和適應性淘汰導致中國馬鈴薯種質資源遺傳基礎極為狹

窄[16]。

3.2 分子生物學考證

段紹光[16]對2012年以前中國審定登記的馬鈴薯品種進行分析，其中共利用423個親本配制組合，自行選育品種379個。作為親本利用10次以上的品種如下：‘多子白’利用27次，‘Epoka’（‘疫不加’）19次，‘Schwalbe’（‘燕子’）19次，‘Katahdin’（‘卡他丁’）17次，‘Mira’（‘米拉’）12次，‘克新2號’12次。邸宏等[17]對中國部分品種資源進行RAPD和AFLP分析，認為中國馬鈴薯種質資源遺傳距離狹窄，柴瑩[18]利用SSR-PCR技術分析得出結論一致。趙光磊等[19]對黑龍江主栽馬鈴薯品種進行RAPD分析，得出同樣結論。李麗等[20]對貴州省審定品種進行SSR分析結論相同，同時得出同一單位育成品種遺傳關系相近。進年來隨著馬鈴薯生物技術的普及，國內學者葉景秀等[21]和段艷鳳等[22]通過試驗都得出馬鈴薯遺傳基礎狹窄的結論。

4 二倍體及其優良性狀

4.1 豐富的二倍體資源

在馬鈴薯的起源中心南美洲，廣袤的Andes山脈和Lake Titicaca盆地原始森林里，分布著大量普通栽培種的祖先二倍體S.stenotomum（2n=2x=24），被當地農民栽培種植。在所有能結塊莖的種里據統計，四倍體僅占11.5%，二倍體約為74%，其中二倍體包含原始栽培種和野生種的大部分[12]。有效的對二倍體資源加以利用，拓寬馬鈴薯遺傳基礎，提升加工品質是當前馬鈴薯育種的當務之急。

4.2 二倍體種及其優良性狀

馬鈴薯共有8個栽培種，在其起源地被當地農民廣泛栽培，其中二倍體馬鈴薯栽培種，有以下4個種[23]。

窄刀種（S.stenotomumjuz.et Buk）：對癌腫病、瘡痂病具有抗性，抗低溫，高淀粉，并含有能產生2n配子和誘導普通栽培種孤雌生殖的基因。

角萼薯（S.goniocalyxJuz.et Buk）：具有多種塊莖顏色和形狀變異。

阿江惠種（S.ajanhuriJuz.et Buk）：塊莖無異味，具有耐寒性。

富利亞種（S.phurejaJuz.et Buk）：長日照下可結薯，熟期短，塊莖休眠期短、淀粉含量較高、低還原糖、蛋白含量略高，抗病毒病和類病毒，抗青枯病、瘡痂病。并含有能產生2n配子和誘導普通栽培種孤雌生殖的基因。

5 二倍體利用方法

馬鈴薯的普通栽培種和二倍體種分屬馬鈴薯不同的種，首先二者之間雜交受花期不遇和授粉環境不同的限制，其次還有授粉成功后表現胚乳敗育和后代易夭折等限制。花期和環境因素等可以人工調節，研究證實[24]后代的敗育是受胚乳平衡數（Endoseperm balance number，EBN）影響。每個種有特定的EBN，當胚乳母本和父本的EBN之比為2∶1的情況下才具有正常的發育能力，后代才能正常成活[25]。

雖然二倍體和四倍體馬鈴薯遠緣雜交受EBN限制，但廣大馬鈴薯育種工作者探索發現，下列操作途徑可克服二者雜交的障礙。

5.1 細胞融合雜交

通過組織培養技術獲得栽培種和二倍體的無菌組培苗，進行液體懸浮培養，然后分別通過酶液在不同溫度下進行預處理，分別獲得二者的懸浮原生質體體系，然后利用化學方法或者電融合方法把二者的原生質體進行融合。通過一定比例和配方的激素進行再生培養，繼代擴繁后對成苗進行鑒定。有研究證實細胞融合可以將二倍體的青枯病抗性有效遺傳給后代[26]。細胞融合的雜種后代可以篩選出具有花粉育性的資源[27]。

5.1.1 化學融合方法

將獲得的原生質體利用一定的促融劑促進細胞相互融合，然后用固定液固定，將融合后的雜交細胞進行分離培養。應用較多的是PEG法，南相日[27]利用PEG法和多聚鳥氨酸法分別獲得了融合后代。李鳳云等[28]通過葉肉原生質體融合，將抗晚疫病的二倍體野生種和由二倍體加倍而成的四倍體馬鈴薯感病材料進行融合，對成苗后代進行晚疫病鑒定，后代中3個株系超過抗性親本，11個株系抗性與抗性親本相當。

5.1.2 電融合方法

利用電細胞融合儀產生的電場進行處理懸浮原生質體，獲得融合后代。蔡興奎等[29]對馬鈴薯原生質體電融合技術進行了相關的探索和優化，在交流（AC）電場100V/cm作用下雙核融合率達43.3%，交流（AC）電場作用時間20 s時核融合率46.2%，時間延長會導致串珠過長、多核融合率增加、雙核融合率降低；直流（DC）電場強度1 100 V/cm頻率60μs脈沖1次條件下雙核融合率最高，加大直流電強度和脈沖的次數都會引起原生質體破裂和串珠結構解體。司懷軍和戴朝曦[30]通過雙單倍體與二倍體電融合試驗，發現正弦波頻率1 MHz的交流（AC）電場150 V/cm和頻率637.5μs的直流（DC）電場強度1 200 V/cm脈沖1次條件下，原生質體融合頻率均可達30%，融合獲得了具有較強分化能力的愈傷組織，并有少量愈傷組織分化為綠色植株。

5.2 對二倍體加倍

通過試驗手段使二倍體加倍與四倍體處于相同倍性水平，然后通過授粉使二者能正常授粉產生具有生活能力的后代。

5.2.1 秋水仙素加倍法

通過利用一定濃度的秋水仙素處理二倍體馬鈴薯野生種的腋芽，可以獲得人工四倍體[31]。秋水仙素浸泡法和混合培養基培養法可以獲得人工多倍體[32]。

5.2.2 細胞融合加倍法

通過前述的細胞融合方法進行試驗，其中存在著自體和異體融合的類型。王清等[33]和戴朝曦等[34]在對馬鈴薯進行電融合體細胞雜交過程中發現，在細胞融合時自體融合頻率高于異體融合的頻率。因此，自體融合可以作為一種加倍手段加以應用。

5.3 分解育種法

該方法簡而言之分為三個步驟，即將四倍體馬鈴薯降倍，在二倍體水平進行雜交、遺傳分析和選擇，恢復四倍體水平。

5.3.1 四倍體普通栽培種降倍

對四倍體的花藥進行組織培養可以誘導產生雙單倍體[35]，當花藥處于小孢子單核靠邊期是取材外植體的最佳時機。趙欣[36]對不同基因型的馬鈴薯栽培種花藥進行培養，發現基因型差異影響培養成功率，高溫33℃預處理3 d效果最佳，碳源為蔗糖時濃度為60 g/L時愈傷誘導率最高，如果用麥芽糖作為碳源效果更好，并發現通過花粉外部形態長度和顏色可以確定小孢子單核靠邊期。盧翠華等[37]利用三份材料進行花藥培養，認為小孢子的發育階段可以通過花藥的外部形態確定，即花藥呈現淺綠到黃綠色時小孢子處于單核靠邊期，這一時期為外植體最佳取材時間，對取得的雙單倍體后代進行了栽培鑒定，發現多數植株能正常開花，花粉可育，并且部分花粉粒為2n花粉粒。越戀和何鳳發[38]對20個馬鈴薯材料的花藥誘導，發現高溫和低溫預處理具有促進作用，高溫黑暗預培養能提高誘導效率，在培養基中加入馬鈴薯提取物和活性炭粉有利于培養。

通過利用優良授粉者的花粉授粉四倍體可以誘導產生雙單倍體，誘導率受誘導材料和母本配合力的影響。東北農業大學（原東北農學院）篩選出的優良授粉者NEA-P16和NEA-P19可以高頻誘發產生雙單倍體[39]。高建軍[40]對誘導孤雌生殖的材料和母本進行了篩選，發現PHU035在試驗中優于IVP101和PHU1.22為最優授粉者，母本‘中天薯10號’與‘夏坡蒂’的坐果率最高。

5.3.2 利用中間“橋梁”種雜交

一般來說，二倍體馬鈴薯的EBN是2，而馬鈴薯雙單倍體的ENB也是2，所以雜交比較容易成功。但是，有時二者親緣關系較遠，就很難直接進行雜交取得成功或者表現為后代不育，這時可以利用作為“橋梁”第三個種加以解決。比如[41]：普通栽培種的雙單倍體與S.sparsipilum雜交后代由于質核互作表現為雄性不育，利用S.chacoense先與栽培種的雙單倍體雜交，后代再與S.sparsipilum雜交，后代不育的問題即可解決[42]。

5.3.3 利用2n配子恢復四倍體水平

在減數分裂過程中，染色體分離異常可產生兩種類型的未減數配子（2n配子），第一次分裂重組（First division restitution,FDR）和第二次分裂重組（Second division restitution,SDR）。FDR在后期Ⅰ同源染色體未進行預期的分離，染色體進行有絲分裂，產生兩個沒有進行減數分裂的小孢子二分體；SDR第二次分裂重組異常，即在同源染色體分裂之后姐妹染色單體不向兩極移動。在二倍體馬鈴薯中部分種具有產生一定比例2n花粉的能力[43,44]，可以加以利用配制4x×2x組合。產生2n卵的概率相對較低[45]，所以對此利用較少。利用二倍體馬鈴薯產生2n配子的能力即可實現二倍體和四倍體的有性雜交，亦是分解育種法中通過有性雜交手段進行多倍化的重要步驟。

6 二倍體研究取得的成績

李成[45]對4x×2x后代選育成功的馬鈴薯品種‘甘農薯2號’、其他栽培品種和二倍體進行蛋白質組學研究，發現二倍體具有四倍體所不具備的一些抗性相關酶和蛋白，其中一些蛋白具有抗逆性功能；在四倍體中具有調節塊莖膨大和細胞增長的相關酶和蛋白，部分蛋白位點在二倍體中是不具備的；‘甘農薯2號’作為雜交后代蛋白質位點兼具二者特點，同時具有一些獨特的蛋白。

Lu等[46]研究發現二倍體的PHU-STN后代大部分無性系的粗蛋白含量高于對照品種‘Atlantic’和‘克新2號’，因此二倍體的種質資源在提高馬鈴薯蛋白含量方面有極高育種價值。李瑩等[47]在加格達奇通過2年田間試驗，發現4x×2x高世代選系比重均值極顯著高于4x×4x后代的均值，并且雜種后代部分株系的比重顯著高于對照品種‘Shepody’，同時指出在二倍體利用上遺傳設計和有效選擇是關鍵。

Hutten等[48]利用二倍體產生的不同類型的2n配子分別進行種間雜交，對后代進行統計分析發現，FDR類型2n配子后代的產量表現具有優勢，SDR類型2n配子后代的熟期變異類型更為豐富，比重方面FDR后代的部分株系高于SDR后代的，熟期、炸片品質方面兩種類型差異不大。Buso等[49]利用二倍體FDR類型2n配子與四倍體雜交后代與四倍體比較研究證實，4x×2x后代塊莖產量和干物質含量高于四倍體后代，有部分株系表現為早熟，塊莖休眠期更短，并認為種間雜交后代需要進行有效的、長期的選擇才能在生產上利用。

盛萬民[50]利用具有富利亞種（S.phurejaJuz.et Buk）血緣材料和四倍體材料進行雙列雜交，認為雜種后代的選系具有高比重的優良特性，比重、芽眼深度、維生素C和淀粉含量遺傳呈現基因加性效應，并且由于細胞質遺傳效應存在具有二倍體血緣的親本做父本或母本，正交和反交分別取得的后代比重差異顯著。這說明二倍體資源在利用上要充分考慮其性狀的細胞質遺傳特性。卜慶云等[51]用富利亞種（S.phurejaJuz.et Buk）和6份四倍體栽培種進行雜交獲得十余個雜交組合，并對其實生苗后代和無性系后代性狀進行了評價與分析，發現實生苗后代和無性系后代在單株產量、淀粉含量、單株結薯數量上極顯著正相關，所以這幾個性狀可以進行早代選擇，并且‘春薯5-DH38’后代綜合入選率較高。

馬鈴薯瘡痂病不但會影響馬鈴薯的外觀品質，而且塊莖發生瘡痂附近的薯肉在油炸時容易發生褐化。瘡痂病是國內馬鈴薯主產區的主要病害之一，廣大種植者和科研工作者一直受其困擾。Haynes等[52]對二倍體PHU-STN后代的271個材料進行瘡痂病抗性鑒定，其中2個極抗、248個抗，這說明二倍體中具有瘡痂病的抗性基因。這說明通過4x×2x雜交，向雜種后代導入二倍體血緣中的瘡痂病抗性基因在理論上是可行的。Braun等[53]在2個二倍體‘US-W4’和‘524-8’構建的分離群體中進行QTL分析，在第11號染色體上定位到與瘡痂病抗性有關的兩個部分重合的QTL表型貢獻率分別為21.0%和18.2%，在4號和6號染色體各定位到1個馬鈴薯耐低溫糖化相關QTL，表型貢獻率分別為17.1%和19.4%，這進一步說明二倍體在加工品質育種上利用價值，且試驗所用‘US-W4’易與栽培種進行雜交。

Jakuczun和Zimnoch-Guzowska[54]以‘Irys’、‘Mila’、‘Bintje’和‘Saturna’4個品種為對照，對未經選擇17個二倍體家系進行評價，發現在多個家系中表皮綠化和內部變綠高度相關，二倍體中可以選出抗光照綠化的材料，且抗綠化的遺傳規律受親本的一般配合力和特殊配合力影響。

7 討論

把握核心親本。美國選育的加工品種都具有核心親本‘Lenape’的血緣[55]，這一點是值得借鑒的。選擇在中國適應范圍廣、綜合性能較好且具有加工所要求的部分品質性狀的品種或者品系作為基礎材料，針對其缺點有目的性的雜交、回交進行改良。

二倍體資源具有部分優良的加工品質，同時也是拓寬現有馬鈴薯遺傳基礎的重要材料，有效地加以利用是當務之急。但這是一把“雙刃劍”，二倍體同時還具有一些不利于生產的性狀，這在雜交選育工作中是要加以汰除。后代的部分性狀在實生苗世代選擇是有效的，在早代選擇并適當的淘汰可以有效降低育種圃場用地面積，解決有限的育種圃場面積和大量繁殖的無性系后代之間的矛盾。

通過雜交技術將二倍體的部分優良性狀、豐富的遺傳異質性有效地向基礎材料中導入，對后代進行有效地品質鑒定和評價，并加以選擇和淘汰。后代的選優和有目的性的雜交改良，持續的進行才能對多個性狀逐步提高，這是個長期工作并不是一蹴而就的。

馬鈴薯優良的品種是在滿足光照、溫度等環境適應性和具有抗逆性的前提下，具有一定的遺傳異質性保證有足夠的產量優勢，多個優良性狀的基因聚合產生的。馬鈴薯油炸加工型品種要求的性狀較多，品質性狀綜合要求較高。在馬鈴薯油炸加工品種的選育上工作是持續而長期的，廣大馬鈴薯育種工作者任重而道遠。