惡性纖維組織細胞瘤中腫瘤睪丸抗原相關基因的表達

董志偉，王健，穆蒼山，谷文光

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院骨科，黑龍江 哈爾濱　150001)

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惡性纖維組織細胞瘤中腫瘤睪丸抗原相關基因的表達

董志偉，王健，穆蒼山，谷文光*

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院骨科，黑龍江 哈爾濱150001)

目的檢測腫瘤睪丸抗原相關基因在惡性纖維組織細胞瘤中的表達，探討其作為靶抗原用于惡性纖維組織細胞瘤特異性免疫治療的可能性。方法收集2010年4月至2015年1月確診為惡性纖維組織瘤并行手術治療的27 例患者的腫瘤組織及癌旁組織。其中男17 例，女10 例；年齡31～83 歲，平均(58.7±13.5) 歲；臨床分期：Ⅰ期5 例，Ⅱ期7 例，Ⅲ期11 例，Ⅳ期4 例；組織學分型：多形性14 例，巨細胞性8 例，炎性5 例。用逆轉錄-聚合酶鏈反應方法對其腫瘤睪丸抗原相關基因(WT1，MPP11，PRAME，RHAMM，NY-CO-38，G250，NY-ESO-1，HTERT，BAGE)的表達進行檢測。結果27 例惡性纖維組織瘤中腫瘤睪丸抗原相關基因的表達頻率分別為WT1 77.8% (21/27)，MPP11 74.1% (20/27)，PRAME 63.0% (17/27)，RHAMM 59.3% (16/27)，NY-CO-38 51.9% (14/27)，G250 44.4% (12/27)，NY-ESO-1 44.4% (12/27)，HTERT 40.7% (11/27)，BAGE 14.8% (4/27)。9種腫瘤睪丸抗原相關基因在正常纖維組織中均無表達。腫瘤睪丸抗原相關基因在惡性纖維組織瘤中表達率最高的WT1與臨床相關指標(性別、年齡、組織學亞型、臨床分期)無顯著相關性(P>0.05)。結論WT1等在惡性纖維組織瘤中呈現高表達，作為主動免疫治療中的攻擊靶點，具有很大的潛力。

惡性纖維組織細胞瘤；腫瘤睪丸抗原；腫瘤疫苗；免疫治療

腫瘤睪丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)是一類腫瘤特異性抗原，僅限在腫瘤組織和睪丸組織中表達，在正常組織中均不表達。CTA呈高度的組織限制性表達，具有免疫原性，可誘導體液免疫與細胞免疫，因而在腫瘤疫苗研究中前景良好[1-2]。目前CTA在惡性纖維組織細胞瘤(malignant fibrous histiocytoma，MFH)中的研究還是一個空白，國內外尚無報道。我們應用RT-PCR方法檢測了27 例MFH患者腫瘤組織中多種CTA的mRNA表達，以為CTA研制用于MFH患者免疫治療疫苗提供理論依據。

1　資料與方法

1.1材料27 例MFH組織及相應的癌旁正常纖維組織均取自哈爾濱醫科大學附屬第一醫院2010年 4月至2015年1月確診為MFH并進行手術治療的患者，腫瘤組織及癌旁正常纖維組織均經病理證實。其中男17 例，女10 例；年齡31～83 歲，平均(58.7±13.5) 歲。術中取材時先取正常纖維組織，再取腫瘤組織，并將組織切成方塊，分裝，放入液氮中保存，隨后置于-80℃冰箱保存。TNM分期按照2010年AJCC標準，Ⅰ期5 例，Ⅱ期7 例，Ⅲ期11 例，Ⅳ期4 例。組織學亞型按照新版WHO軟組織腫瘤分類(2002)進行：多形性MFH 14 例、巨細胞性MFH 8 例，炎性MFH 5 例。

1.2方法a)總RNA的提?。簩⑶腥〉腗FH組織和癌旁組織迅速放入液氮中，快速轉移至-80℃冰箱內存放。用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取組織總RNA，紫外分光光度計測定A260 nm/A280 nm值，1%瓊脂糖凝膠電泳證實RNA完整性。b)cDNA合成：取組織提取RNA 1.0 μg，用RT-PCR試劑盒DRR019A(TAKARA公司)合成cDNA，反應條件和反應體系參考試劑盒說明書。c)聚合酶鏈反應擴增目的基因：取分別來自MFH組織和相對應的癌旁正常纖維組織的cDNA為模板進行PCR反應，以GAPDH為內參，對WT1，MPP11，PRAME，RHAMM，NY-CO-38，G250，NY-ESO-1，HTERT，BAGE的基因進行檢測，引物設計參見文獻[3]。9種CTA基因的引物序列、PCR反應退火溫度、產物片段長度以及循環數見表1。對于所有的抗原，變性溫度為94℃，延伸溫度72℃。全部引物均經GenBank查詢，為目前已知基因特異性引物序列。所有反應均經預變性，94℃ 5 min，擴增35個循環，72℃延伸5 min。d)DNA序列測定：隨機抽取上述9種CTA的陽性PCR產物(各3 例)進行DNA序列測定。DNA序列測定由上?；瞪锛夹g公司完成。所得序列與基因庫檢索序列一致，證實所擴增產物為目的基因的片段。e)將在惡性纖維組織瘤中表達率最高的腫瘤睪丸抗原相關

基因與臨床相關指標(性別、年齡、組織學亞型、臨床分期)進行統計學分析，尋求是否存在關聯。

1.3統計學處理計數資料行χ2檢驗，全部數據由SPSS 19.0統計軟件完成，P<0.05為有統計學意義。

2　結　　果

2.1CTA基因在MFH及相對應癌旁正常纖維組織中的表達在27例MFH組織標本中，表達率最高的是WT1(77.8%)，其次是MPP11(74.1%)，PRAME(63.0%)，RHAMM(59.3%)，NY-CO-38(51.9%)，G250(44.4%)，NY-ESO-1(44.4%)，HTERT(40.7%)，BAGE(14.8%)，如圖1所示。9種CTA基因在全部正常纖維組織中均無表達。腫瘤組織中至少有1種基因表達的頻率是96.3%(26/27)，3種或3種以上同時表達概率為85.2%(23/27)。

圖1　惡性纖維組織細胞瘤組織標本中CTA的mRNA表達結果

2.2在MFH中CTA基因的表達與臨床指標的關系經統計學分析，CTA基因在MFH中表達率最高的WT1與臨床相關指標(性別、年齡、組織學亞型、臨床分期)無顯著相關性(P>0.05)，如表2所示。

表1　9種CTA基因PCR引物序列、反應退火溫度、循環數以及產物片段長度

表2　WT1在惡性纖維組織細胞瘤中的表達與相關臨床指標的關系

3　討　　論

MFH是一種較為常見的軟組織肉瘤，惡性程度高，易發生轉移和復發，預后差。在現階段，由于病因未得到確定，對于MFH的早期診斷、病程監控、治療都沒有確切的辦法。近年來，MFH患者生存率隨著治療方法的改進得到一定程度的提高。但即使采取以手術徹底切除加長期化療的方法，患者的五年生存率仍低于70%[4-5]。這種腫瘤嚴重威脅著人類的生命健康，因此急需尋找新的方法來提高治療效果。

近年來，隨著腫瘤學、免疫學以及分子生物學等相關學科的發展，腫瘤免疫治療的研究突飛猛進，成為繼手術、放療和化療之后第四種抗腫瘤治療手段。目前，在腫瘤治療中免疫治療只能作為輔助手段，原因有兩個：其一是真正實用的腫瘤特異性抗原十分有限；其二是受多種因素影響，這些僅有的抗原免疫原性低，難以完成抗原的有效遞呈，因而開展免疫治療的關鍵所在是獲得特異性腫瘤抗原[1]。作為免疫治療其中之一，基因疫苗的治療策略是利用人體免疫系統已存在的病原體免疫反應，將腫瘤特異性標記物的基因序列與病原體的基因序列融合制成基因疫苗，在人體內激活高水平的T淋巴細胞，從而誘導、維持有效的免疫應答反應，達到治療目的。由于疫苗治療具有特異性、在體內免疫效應維持時間長等優點，目前以CTA肽為主的疫苗已成為研究熱點[1，6-7]。

1991年有學者通過改進T細胞表位克隆從黑色素瘤細胞中分離并鑒定了第一個腫瘤睪丸抗原MAGE-1，CTA逐漸被人們熟知。CTA基因在正常組織(睪丸和胎盤組織)和某些腫瘤細胞中表達[2]。除此之外，作為一類新的腫瘤特異性抗原，CTA還有如下主要特點：a)大多數CTA基因定位于X染色體；b)一般以多個家族成員的形式存在；c)CTA在各種來源不同的腫瘤組織中的表達一般具有異質性[8]。目前有關研究發現CTA基因及其編碼產物CTA在細胞分化增殖、細胞凋亡、信號傳導、基因轉錄、減數分裂等方面起作用[9-12]。此外，多項研究報告表明，作為腫瘤標記物，還可通過巢式RT-PCR技術檢測外周血、腦脊液、腹水中CTA的mRNA的表達及含量，有助于發現少量腫瘤細胞的存在，從而用于腫瘤的早期診斷及轉移復發的監測[8]。

目前，雖然大部分CTA功能尚未完全明確，與腫瘤的發病機制也未查明，但是CTA因具有免疫原性及表達局限性，而且CTA基因編碼的200余個產物已被鑒定，為含有CTA的惡性腫瘤的免疫治療提供了充分的選擇，使其在腫瘤疫苗和腫瘤免疫治療中極具發展潛力，成為一研究熱點[1，13]。近年來，隆起性皮膚纖維肉瘤、尤文氏肉瘤、白血病等腫瘤相繼發現了特異性標記物，而且，CTA的臨床試驗在黑色素瘤等腫瘤的治療上已取得了令人鼓舞的進展[14-15]，但MFH的特異性標記物卻沒有相關報道。

為了解CTA在MFH中的表達特點，我們檢測了9種CTA基因在MFH組織的表達，發現這些CTA基因均有不同程度的表達，表達率最高的是WT1(77.8%)，其次是MPP11(74.1%)，PRAME(63.0%)，RHAMM(59.3%)，NY-CO-38(51.9%)，腫瘤組織中至少有1種基因表達的頻率是96.3%(26/27)，3種或3種以上同時表達概率為85.2%(23/27)；全部CTA基因在正常纖維組織中均無表達。本組實驗還對表達率最高的WT1的表達和臨床相關指標(性別、年齡、組織學亞型、臨床分期)的關系進行了分析，結果顯示無顯著相關性，但本實驗病例較少，是否存在關聯有待進一步研究驗證。結果提示上述5種CTA基因在MFH中呈現高度特異性表達，由于CTA在腫瘤中呈現異質性表達，這就為開展研究MFH的多價疫苗提供了實驗依據，使得CTA作為腫瘤疫苗用于MFH的特異性免疫治療成為可能，

而且多價疫苗還可有效避免因腫瘤抗原表達的個體差異和抗原調變所致的免疫逃逸，進而擴大了免疫治療適用范圍，效果明顯優于單一多肽疫苗。

CTA基因的研究把腫瘤發生、發展與生殖細胞的產生和成熟緊密聯系在了一起，如上所述，CTA在眾多腫瘤中均有不同頻率的表達，而且多呈協同表達。Lee等[16]發現長期存活的睪丸癌患者有繼發惡性纖維組織細胞瘤的可能，因CTA具有高度的表達限制性，提示CTA在惡性纖維組織細胞瘤中可能出現高表達，本次試驗結果與多種CTA在惡性纖維組織細胞瘤中呈現高表達相符合，而且多種CTA之間存在協同表達現象。由于本次試驗的局限性，CTA與惡性纖維組織細胞瘤之間的關聯仍需要更多的研究來檢驗。

本次實驗結果提示我們應將表達率最高的WT1作為MFH的特異性腫瘤標記物，并對其臨床應用進行探索。研究成功將發現新的腫瘤特異性標記物并有可能應用于MFH的早期診斷、病程監控、療效評價、轉移預后等方面。同時，新的特異性標記物將進一步研究用于開發MFH特異性基因疫苗，提高免疫治療效果，具有較為廣闊的經濟社會前景。

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Expression of Cancer/testis Antigen-related Genes in Malignant Fibrous Histiocytoma

Dong Zhiwei，Wang Jian，Mu Cangshan，etal

(The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Haerbin 150001，China)

ObjectiveTo detect the expression of cancer/testis antigen related genes in malignant fibrous histiocytoma and to investigate the possibility of applying the antigens as the target antigens for malignant fibrous histiocytoma specific immunotherapy.MethodsTumor tissues and adjacent noncancerous tissues were collected in 27 patients diagnosed as malignant fibrous histiocytoma and received operation from April，2010 to January，2015.Among them，there were 17 male and 10 female with the average age (58.7±13.5) years old (31～83 years old).According to staging，5 cases were staged in Ⅰ，7 in Ⅱ，11 in Ⅲ，4 in Ⅳ；14 cases were of pleomorphic，8 cases of giant cell and 5 cases of inflammatory out of 27 cases.Reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was adopted to investigate the expression of cancer-testis antigen related genes(WT1，MPP11，PRAME，RHAMM，NY-CO-38，G250，NY-ESO-1，HTERT，BAGE)of the tumor tissues and adjacent noncancerous tissues.ResultsThe expression rates of cancer-testis antigen related genes in the 27 cases of malignant fibrous histiocytoma were WT1 77.8% (21/27)，MPP11 74.1% (20/27)，PRAME 63.0% (17/27)，RHAMM 59.3% (16/27)，NY-CO-38 51.9% (14/27)，G250 44.4% (12/27)，NY-ESO-1 44.4% (12/27)，HTERT 40.7% (11/27)，BAGE 14.8% (4/27) respectively；almost none of the adjacent noncancerous tissues were positive for these genes.There was no significant correlation (P>0.05) between cancer-testis antigen related genes WT1 with the highest expression rate in malignant fibrous histiocytoma and clinical correlation index (gender，age，histologic subtypes，clinical stages).ConclusionThe cancer-testis antigen related genes(WT1 et al) which represent high expression in malignant fibrous histiocytoma are suitable and potential attack target for the active immunotherapy of malignant fibrous histiocytoma.

malignant fibrous histiocytoma；cancer/testis antigen；tumor vaccine；immunotherapy

1008-5572(2016)05-0425-04

黑龍江省博士后科研啟動基金(LBH-Q12041)；*本文通訊作者：谷文光

R73-3

B

2015-09-11

董志偉(1988- )，男，醫師，哈爾濱醫科大學附屬第一醫院骨科，150001。