重組人2型松弛素對人支氣管上皮Bease-2B細胞上皮-間質轉化的抑制作用的時間相關性研究

劉國清 馬繼龍 謝立波

摘 要：目的：通過體外細胞實驗探索重組人2型松弛素（RLN2）參與抑制轉化生長因子-β1（TGF-β1）誘導支氣管上皮細胞Bease-2B細胞的上皮-間質轉化（EMT）過程。方法：本研究選取Bease-2B細胞株作為模式細胞，體外培養。1）通過觀察細胞形態變化初步確定TGF-β1誘導濃度以及RLN2對TGF-β1誘導的Bease-2B細胞EMT的有效干預濃度;2）RLN2抑制TGF-β1誘導Bease-2B細胞EMT的時間：將細胞分別于TGF-β1誘導的同時和誘導24小時后加入RLN2培養24小時，及在TGF-β1誘導24小時后加入RLN2組分別作用24小時和48小時后：①通過觀察細胞遷移能力推測RLN2不同作用時間對TGF-β1誘導的細胞EMT抑制效果;②通過Western bloting法檢測各組間質標志ACTA2，上皮標志E-Cadhrin表達情況分析抑制效果與作用時間的關系。結果：1）觀察細胞形態變化：與正常組比，10ng/mL TGF-β1誘導組Bease-2b細胞由鋪路石狀上皮形態逐漸變成梭形、針葉型，且細胞之間的間隙變大，胞間的連接變得松散;加不同濃度的RLN2抑制細胞48小時后，與單純TGF-β1組相比，梭形形態的細胞減少，部分恢復鋪路石狀上皮形態，但細胞間連接仍然松散，其中TGF-β1同時加RLN2 80ng/mL組表現明顯。2）遷移能力，各組與單純TGF-β1誘導組比較平均遷移距離均減小，誘導24小時后加RLN2抑制組比誘導抑制同時進行的組的遷移距離大，誘導24小時后加RLN2培養48小時組比抑制24小時組遷移距離小。3）Western bloting檢測分析抑制效果與時間的關系：單純RLN2組和正常組比較E-Cadhrin和ACTA2蛋白的表達均無顯著性差異;各組與單純TGF-β1組比較E-Cadhrin表達量均增加，ACTA2蛋白的表達減少;誘導抑制同時進行的組與誘導24小時后加RLN2抑制組比較E-Cadhrin表達量增加，ACTA2蛋白的表達減少;誘導24小時后加RLN2培養48小時抑制組比抑制4小時組ACTA2蛋白的表達少，E-Cadhrin表達量無差別。結論：①TGF-β1可誘導支氣管上皮細胞轉分化為間質細胞。②松弛素可在一定程度上抑制TGF-β1誘導的EMT過程且與作用時間相關。③松弛素可能通過抑制TGF-β1誘導的EMT過程發揮抗纖維化作用。

關鍵詞：2型松弛素;上皮間質轉化;轉化生長因子β1;Bease-2B細胞

兒童支氣管哮喘、閉塞性細支管炎、反復呼吸道感染等疾病常導致氣管、支氣管及其周圍的慢性炎癥，長期反復的炎癥刺激和上皮損傷最終會導致細支氣管黏膜、黏膜下和管壁外周的纖維化和小氣道的重塑[1]，嚴重的氣道重塑可致氣道狹窄甚至阻塞，引起肺功能不全。覆蓋于氣道表層的上皮，在反復的損傷和不良刺激下會導致上皮細胞的完整性和固有特性被打亂和重排，發生形態和功能的改變，上皮細胞間質轉化（EMT）就是其中之一，近年國內外研究表明肺泡上皮細胞-間質細胞轉分化是氣道纖維化的重要機制之一[2]。松弛素（RLN）是一類功能廣泛的細胞因子，越來越多的證據表明RLN具有抗纖維化作用[3]，其作用可能主要是通過抑制TGF-β1的活性，從而抑制成纖維細胞的增殖、分化，和抑制膠原的合成、分泌和沉積達到的。本研究通過TGF-β1誘導的支氣管上皮細胞的體外上皮間質轉化實驗探討重組人2型松弛素對支氣管上皮細胞間質轉化抑制作用的時間相關性。

1 材料

Bease-2B細胞購自中國科學院細胞典藏庫，重組人2型松弛素美國Peprotech公司生產，重組人TGF-β1上海近岸蛋白科技公司生產，E-cadherin抗體、α-SMA抗體Proteintech公司生產，DMI3000B熒光倒置顯微鏡購自德國徠卡儀器公司。

2 方法

2.1 Bease-2B細胞的常規培養和實驗前處理

采用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養基培養基，37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度的培養條件。常規培養細胞和傳代。選擇對數生長期的細胞，在傳代過程中逐漸降低培養液的胎牛血清含量，選擇適應4%FBS的培養基的細胞接種于六孔板常規培養，至細胞融合度達到70%左右時，換為含1%FBS的完全培養液培養12h，然后進行后續實驗。

2.2 Bease-2B細胞的向間質細胞轉化

通過文獻得知，5ng/mL、10ng/mL的TGF-β1可以在體外誘導支氣管上皮細胞轉化為間質細胞[4，5];經過實驗觀察得出10ng/mL的TGF-β1培養48h及以上，可誘導支氣管上皮細胞（Bease-2B）明顯轉化為間質細胞表型，即細胞從鵝卵石樣逐步轉變成梭形或長條形，轉化成功率高。

2.3 顯微鏡觀察不同濃度RLN2對TGF-β1誘導細胞轉化的影響

經過查文獻得知，以往松弛素在體外細胞實驗中的濃度是10ng/mL、100ng/mL[6，7]，本研究通過細胞實驗和顯微鏡下觀察細胞形態，初步確定80ng/mL的RLN2對TGF-β1誘導的上皮細胞轉化的抑制明顯，且對細胞存活干擾較小。

2.4 RLN2作用時間對TGF-β1誘導細胞遷移能力的影響

穩定傳代饑餓處理好的細胞分六組并編號k、t、t+48r、t+24r、r、t+r，k組換為1%FBSRPMI1640培養基，t、t+48r、t+24r組換為含10ng/mL TGF-β1的1%FBS培養液，t+r組為含80ng/mL RLN2及10ng/mL TGF-β1的FBS培養液，r組只含80ng/mL RLN2的FBS培養液，連續培養24h后，用無菌200μL移液器槍頭在細胞層垂直六孔板做3條平行劃痕，t+24r、t+48r組改為含80ng/mL RLN2及10ng/mL TGF-β1的1%FBS培養液，其他組所換培養液不變，t+24r組繼續培養24h，t+48r組培養48h，置于倒置顯微鏡下觀察并照相記錄，并用記號筆圈標顯微鏡在六孔板蓋上的光斑，作為后續觀察記錄點，以后每隔8h觀察記錄一次，結果如圖1A所示。利用ImageJ2軟件，測量劃痕倆側細胞間距，對24h后細胞遷移的距離進行統計分析。

2.5 Western blotting法檢測Bease-2B細胞在經過TGF-β1和RLN2處理不同時間后E-Cad、ACTA2蛋白的表達情況

穩定傳代饑餓處理好的細胞分六組并編號k、t、t+24r、t+48r、r、t+r，k組換為1%FBSRPMI1640培養基，t、t+24r、t+48r組換含10ng/mL TGF-β1的1%FBS培養液，t+r組換含80ng/mL的RLN2及10ng/mL的TGF-β1的1%FBS培養液，r組換含80ng/mL的RLN2的1%FBS培養液，連續培養24h后，t+24r、t+48r組改為含80ng/mL RLN2及10ng/mL TGF-β1的FBS培養液，其他組所換培養液不變，t+24r組持續培養24h，t+48r組繼續培養48h。最后提蛋白進行Western blotting檢測，結果見圖2A，用ImageJ圖像分析軟件測條帶的灰度后，分別用E-Cadhrin蛋白和ACTA2蛋白的灰度條帶參數值除以β-actin蛋白條帶的灰度參數值得出相對蛋白含量，結果見圖2B。

圖2 Western blotting法檢測Bease-2B細胞在經過TGF-β1和RLN2處理不同時間后E-Cad、ACTA2蛋白的表達情況

注：1空白對照組，2 TGF-β1組，3. 先TGF-β1后加RLN2培養48h組，4 先TGF-β1后加RLN2培養24h組，5. RLN2對照組，6.TGF-β1與RLN2 同時加入培養48h組，*P<0.05

3 結果

3.1 RLN2作用時間對TGF-β1誘導細胞遷移能力的影響

各組的平均遷移距離分別為：0.20±0.70μm、21.74±115μm、13.17±1.10μm、17.53±1.00μm、0.52±0.91μm、291±1.01μm，單純松弛素r組和空白組兩者對照無顯著性差異（P>0.05），各組跟單純TGF-β1誘導的t組比較平均遷移距離均減小（P<0.05），誘導24小時后加RLN2抑制的t+48r組與誘導和抑制同時進行的t+r組比較遷移距離增加（P<0.05），誘導24小時后加RLN2培養48小時抑制的t+48r組與培養24小時抑制的t+24r組比較遷移距離減少（P<0.05），見圖1B。另外在長時間的饑餓培養過程中由于細胞的死亡空白組的劃痕間距有所增寬，而在相同培養時間里單純應用RLN2的組細胞死亡數量較少，此現象可能是因為RLN2提高了細胞在饑餓培養中的耐受力。

3.2 Western blotting法檢測Bease-2B細胞在經過TGF-β1和RLN2處理不同時間后E-Cad、ACTA2蛋白的表達情況

單純RLN2組和空白對照組兩者比較E-Cadhrin蛋白和ACTA2蛋白的表達無顯著性差異（P>0.05）;各組與單純TGF-β1組比較E-Cadhrin蛋白表達量均增加（P<0.05），ACTA2蛋白的表達減少（P<0.05）;誘導和抑制同時進行的t+r組與誘導48小時后加RLN2抑制的t+48r組比較E-Cadhrin蛋白表達量增加（P<0.05），ACTA2蛋白表達減少（P<0.05）;誘導24小時后加RLN2培養48小時抑制的t+48r組與培養24小時抑制的t+24r組比較E-Cadhrin蛋白表達無差別（P>0.05），ACTA2蛋白表達減少（P<0.053）見圖2。

4 討論

目前肺部纖維化中的EMT的調控機制尚不完全清楚，TGF-β1是目前確認可以引起上皮間質轉變的因素之一[2]，成纖維細胞、上皮細胞等多種細胞均可以合成產生TGF-β1并依靠旁分泌和或自分泌的形式調控細胞的增殖、分化、遷移，細胞外基質的代謝、組織損傷修復等。在氣道慢性疾病發展過程中，長期反復的上皮損傷和炎癥刺激會誘導上皮細胞及病灶中浸潤的炎癥相關細胞分泌TGF-β1，TGF-β1受體激活后可抑制細胞上皮特征的基因表達，同時上調纖維化特異性基因的表達，進而影響細胞骨架與細胞黏附分子的功能，促使上皮細胞向間質細胞轉化[8]，最終上皮細胞失去其上皮表型，例如上皮細胞E鈣粘素（E-Cadherin）、角蛋白等上皮細胞標志物表達丟失，并獲得間質細胞的表型特征，例如-平滑肌肌動蛋白（ACTA2）等間質細胞標志物表達上調[9]。

松弛素是一類功能廣泛的細胞因子，隨著研究的深入，發現RLN具有較強的抗纖維化作用，其抗纖維化可能主要是通過抑制TGF-β1的活性，從而抑制成纖維細胞的增殖、分化，抑制膠原的合成、分泌和沉積達到的。目前已有大量的研究證實RLN在心臟、肝臟等全身多個器官有廣泛的表達，并能抑制這些器官的纖維化的進展[10]。

本研究開始用不同劑量的松弛素用于TGF-β1對Bease-2B細胞的誘導過程，通過對細胞形態學上的觀察發現，10ng/mL的TGF-β1誘導Bease-2B細胞24h后可觀察到有大量細胞發生形態變化，誘導48h后細胞明顯向間質細胞形態轉化。在TGF-β1誘導同時加RLN2 80ng/mL的組抑制細胞形態變化最為明顯，本研究分別在加入TGF-β1同時和加入TGF-β1 24h后加入RLN2，并且分別在RLN2作用達到24h和達到48h時檢測細胞的遷移距離以及E-cadhrin、ACTA2兩種細胞標志蛋白的表達情況。實驗結果顯示：各組與TGF-β1組比較遷移能力均較弱，E-Cadhrin表達量高，ACTA2蛋白的表達量低，可認為80ng/mLRLN2作用24h可以抑制TGF-β1對上皮細胞的誘導作用;與同加入TGF-β1和RLN2的組比較，在加入TGF-β1培養24h后再加入RLN2的兩組，遷移能力均較強且E-Cadhrin表達量較低，ACTA2蛋白的表達量較高，說明在誘導早期加入的抑制轉化效果要高于誘導后期;用RLN2作用48h和作用24h的兩組比較，作用48小時的組遷移能力略強，ACTA2蛋白的表達量略減少（P<0.053），但兩組E-Cadhrin的表達量無差別（P>0.05），說明RLN2對TGF-β1誘導上皮轉化可能存在一定的時間依賴性，由于誘導上皮間質轉化的實驗是在細胞饑餓條件下進行的，隨著饑餓培養的時間的延長，細胞耐受力下降，實驗誤差增大，所以對于RLN2抑制TGF-β1誘導上皮間質轉化的時間依賴性實驗嘗試尚有待于改良。