野生黑茶抗氧化活性研究

何英姿 王曉 梁傳順 李穩 潘慶松 覃繼忠

摘 要：本文分別用三種不同極性的溶劑（石油醚、乙酸乙酯和正丁醇）提取野生黑茶中抗氧化活性物質，并測定了三種自由基的清除率，與合成抗氧化劑Vc和蘆丁進行對比。結果表明：隨著野生黑茶提取物濃度的增加，其對DPPH自由基、·OH自由基和超氧陰離子的清除能力逐漸增強，同時發現野生黑茶對DPPH自由基和·OH自由基清除能力都是乙酸乙酯提取物的自由基清除活性較強。黑茶提取物對DPPH自由基·OH自由基的清除率分別到達93.63%和77.85%。而對超氧陰離子自由基則是正丁醇相提取物的自由基清除活力較強，清除率達到42.25%。結論：野生黑茶不同溶劑提取物對三種自由基的清除效果良好，說明其中富含抗氧化活性物質，這為野生黑茶的進一步開發利用提供了參考依據。

關鍵詞：野生黑茶;極性溶劑;提取物;自由基清除率;抗氧化

Abstract：In this paper，the antioxidant active substances were extracted from Wild Dark Tea respectively with three different polar solvent（petroleum ether，ethyl acetate and n-butanol）.The scavenging activity was determined on both DPPH，hydroxyl radicals（·OH）and superoxide anion，and was compared with synthetic antioxidant vitamin C and rutin.The results showed that：in the experimental concentration range，with the increase of the extract concentration，the scavenging capacity on DPPH radical，hydroxyl radical and superoxide anion radical gradually increased，and also found that the ethyl acetate extraction of Wild Dark Tea had stronger scavenging capacity on DPPH radical and hydroxyl radicals.The scavenging capacity radical can reach 93.63% and 77.85% respectively.While the scavenging activity on superoxide anion radical was stronger in chloroform extraction，and the radical scavenging rate was 42.25%.In conclusion，the extractions of Wild Dark Tea in different polar solvent had effectively scavenging activity on DPPH radical，hydroxyl radicals and superoxide anion radical.So Wild Dark Tea is rich in antioxidant active substances.These can provide the reference basis for the further development and utilization of Wild Dark Tea.

Key words：Wild Dark Tea; polar solvent; extract; radical scavenging; antioxidant

廣西柳州市融水縣原始森林里的原生品種茶樹，優良的品質和特有的風味受到了很多專家和學者的青睞和高度重視，國家農業部、科技部相繼在融水建設“廣西元寶山野生茶種質資源原生境保護區”和全國唯一一個“國家茶產業工程技術研發中心，使得本地黑茶產品特色與品質、原始稀缺性、安全性等各方面均表現出得天獨厚的自然優勢。黑茶的抗氧化活性一直以來備受矚目。普洱茶作為黑茶的代表被廣泛研究。金裕范等[1]對普洱茶清除DPPH自由基的效率進行了測試，發現5個產地的普洱茶均具有能不同程度地清除DPPH自由基，并隨產地不同而有差別。有學者[2]研究發現普洱茶對羥基自由基有很好的清除能力。還有學者[3]采用不同的有機溶劑萃取普洱茶提取物，結果發現普洱茶乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物對羥基自由基和DPPH均有較好的清除效果。對于廣西柳州市融水縣的野生黑茶，未見研究報道。

本實驗采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取野生黑茶的抗氧化活性物質，通過測定其自由基清除能力，研究野生黑茶的抗氧化性能，旨在為進一步開發和利用野生黑茶提供參考。

1 試驗材料和方法

1.1 實驗材料

（1）實驗藥品試劑。野生黑茶由廣西柳州市融水縣水融香茶業有限公司提供。DPPH·自由基（二苯代苦味肼基自由基）購于上海楷洋生物技術有限公司，蘆丁購于國藥集團化學試劑有限公司，乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、PBS緩沖液、鄰二氮菲（菲啰啉）、FeSO4·7H2O、去離子水、H2O2，其他試劑均為國產分析純。

（2）儀器與設備。手提式高速中藥粉碎機、標準篩、分析天平、真空旋轉蒸發儀、抽濾裝置、紫外可見分光光度計、電熱恒溫水浴鍋、冷凍干燥器、超聲波清洗機、調溫電熱套。

1.2 實驗方法

（1）樣品制備。先將野生黑茶粉碎，用標準篩進行篩選備用[4]。稱取野生黑茶粉末兩千克，放在95%的乙醇中浸泡幾天。過濾浸提液，再用真空旋轉蒸發儀減壓懸蒸，得總浸膏55.2g。取蒸餾水溶解浸膏，超聲溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取所得提取液減壓濃縮至浸膏，分別得到石油醚相92545g，乙酸乙酯相17.7129g，正丁醇相221440g，水相44968g。將各樣品冷凍干燥后，置于冰箱中保存備用[5]。

（2）DPPH自由基的清除能力測定。分別將野生黑茶提取液經萃取后的各極性部分浸膏、蘆丁和Vc，用無水乙醇配制成濃度為1mg/mL的溶液，做DPPH自由基的清除能力測定時再分別稀釋至0.05、0.10、0.15、020、0.25mg/mL。用分析天平準確稱量DPPH0.0597g，然后用無水乙醇溶解定容至250ml容量瓶中，即可得到濃度為6×10-4mol/L的DPPH溶液，備用，避光冷藏。

按表1中加入溶液后充分搖勻，靜置在黑暗處30min，用無水乙醇為空白，在波長517nm下測定溶液A0、Ai、Aj相對應的吸光度值，記錄數據，根據清除率公式計算其清除率值[6]。

（3）測定羥基自由基的清除能力。①最大吸收波長的確定：取10mL具塞比色管，逐一加入0.8mmol/L鄰二氮菲溶液3mL，PBS緩沖溶液4mL，去離子水1mL，混合均勻，再滴加08mmol/L的硫酸亞鐵溶液1mL，接著滴加95%的乙醇1mL，搖勻后放在37℃的水浴中溫浴1h，空白對照為去離子水，在紫外-可見分光光度計上190nm～800nm進行波譜掃描，確定最大吸收波長為510nm[7]。②樣品測定：取10mL具塞比色管，逐一加入0.8mmol/L鄰二氮菲溶液3mL，PBS緩沖溶液4mL，去離子水1mL，混合均勻，再滴加0.8mmol/L的硫酸亞鐵溶液1mL，即獲得反應液;然后按表2加入不同溶液進行測定。

分別取1mg/mL的樣品（對照為Vc）溶液0.2、0.4、0.6、08、1.0mL放入帶塞子的比色管中，然后對應加入0.8、0.6、04、0.2、0mL的去離子水，搖勻，逐一加入鄰二氮菲溶液3mL，PBS緩沖溶液4mL，搖勻后加入硫酸亞鐵溶液和H2O2溶液各1mL，于37℃的水浴鍋中溫熱一小時，在波長為510nm處測定吸光度值，記為Aj。溶液羥基自由基清除率公式：

（4）測定超氧陰離子自由基的清除作用。①最大吸收波長的確定：將3mL Tris-HCI緩沖溶液、4mL鄰苯三酚溶液逐一加入10mL的比色管中，震蕩搖勻，用蒸餾水定容至刻度。將蒸餾水作為空白對照，在紫外-可見分光光度計190nm～800nm范圍內掃描，從而確定出最大吸收波長為320nm。②樣品測定：分別取1mg/mL的樣品溶液（對照為蘆?。?、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL的比色管中，逐一加入Tris-HCl緩沖溶液3mL、鄰苯三酚溶液4mL，讓其充分反應5min后，用0.1mol/L的鹽酸溶液終止反應，滴入蒸餾水補充至刻度，在320nm處測得吸光度值A0、Ai。另外取1mg/mL的樣品溶液0.2、0.4、06、0.8、1.0mL，分別加入3mLTris-HCl緩沖溶液、0.1mL鹽酸溶液于10mL比色管中，用蒸餾水定容至刻度，在波長320nm處測其吸光度值Aj。

其中，A0為鄰苯三酚自氧化的空白吸光度值;Ai為加入樣品后鄰苯三酚自氧化的吸光度值;Aj為樣品和緩沖溶液的吸光度值，即樣品樣色對自氧化的干擾值[9]，作圖分析清除率作用。

2 結果與分析

2.1 野生黑茶中各極性萃取物對DPPH的自由基的清除

根據所得數據作圖，如圖1所示，各極性萃取物對DPPH的自由基清除率均隨著樣品濃度值增加而增大，對照品Vc的活性最高，石油醚相最低，當樣品濃度增加到015—025mg/mL時，表現比較好的是乙酸乙酯相和正丁醇相，兩者的清除率均高于對照品蘆丁的清除率，并非常接近對照品Vc的清除率值，達到了93.63%。通過數據分析可知野生黑茶有較好的清除DPPH自由基的活性。

2.2 野生黑茶中各極性萃取物對羥基自由基的清除

通過作圖分析可知（如圖2），各極性部分的清除率基本隨濃度的增加而遞增，其中乙酸乙酯相遞增最快，在0.4mg/mL時高于其他各相，隨著濃度持續增加，各極性萃取物對羥自由基的清除能力繼續增大，并逐漸趨于穩定，各相中以乙酸乙酯相的清除率為最好，和Vc的清除率值比較接近，達到77.85%。因此，野生黑茶對羥自由基有較好的清除活性。

2.3 野生黑茶中各極性萃取物對超氧陰離子自由基的清除

通過作圖分析可知（如圖3），樣品對超氧陰離子自由基的清除率基本是隨著各自濃度的增加而呈上升趨勢。在0.4～0.8mg/mL時，正丁醇相顯示出較好的抗氧化活性，其清除率高于對照品蘆丁。在濃度為1mg/mL時，正丁醇相的清除效率最好，達到42.25%，但比對照品蘆丁低，其次是乙酸乙酯相和石油醚相。可知野生黑茶對超氧陰離子自由基有較好的清除活性。

3 結論

本文主要對野生黑茶不同極性溶劑提取物的抗氧化活性進行測定，選取了DPPH自由、羥基自由基和超氧陰離子自由基進行清除率實驗，用Vc和蘆丁作為對照品。實驗結果表明，野生黑茶各極性部分均有較好的抗氧化活性，其中對DPPH自由基的清除效果最好，乙酸乙酯相和正丁醇相的清除率接近于對照品Vc的清除率;對羥基自由基的清除則是乙酸乙酯相的效果最好，明顯高于其他三相的清除率;而正丁醇相對超氧陰離子自由基的清除最好，與對照品蘆丁比較接近。因此，通過對比數據可知，野生黑茶提取物的乙酸乙酯相、正丁醇相活性較好，這為野生黑茶的進一步開發利用提供了參考依據。

參考文獻：

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