粳稻蔗糖轉運蛋白基因OsSUTs在灌漿期的表達特點

呂東 李丹丹 徐汝聰

摘要：蔗糖轉運蛋白編碼基因（SUTs）的表達在植物生長發育過程中的蔗糖轉運與分配途徑中起著至關重要的作用。由粳米生產的稻米具有良好的適口性，其市場需求量也越來越大，在稻米生產過程中，灌漿期是決定水稻產量和品質的重要時期。由此可見，研究粳稻灌漿期蔗糖轉運蛋白編碼基因（OsSUTs）的表達可為高產優質粳稻品種的選育和栽培提供有價值的參考。以云南農業大學稻作研究所保育的粳稻品系為材料，研究粳稻灌漿期葉片、穗部中OsSUTs基因的表達特點。結果表明，在粳稻葉片中，OsSUT2基因的表達量最高，而其余4個基因的表達量由高到低排序依次為OsSUT4、OsSUT1、OsSUT5、OsSUT3。穗部不同基因表達量的排序基本與葉片中的相同，由高到低為OsSUT2、OsSUT4、OsSUT5、OsSUT1、OsSUT3，不同的是OsSUT5與OsSUT1表達量的排序位置發生了對調。對比葉片、穗部中OsSUTs基因的表達量發現，除OsSUT1基因在穗部中的表達量低于在葉片中的表達量外，其他4個基因（OsSUT2、OsSUT3、OsSUT4、OsSUT5）的表達量均是穗中高于葉片中。在葉片中，OsSUT3、OsSUT4、OsSUT5這3個基因間的相關性較高，呈極顯著正相關關系;但在穗中，OsSUTs基因間的相關性都較高，而且都達到了極顯著正相關水平。研究結果可為人們深入認識水稻OsSUTs基因的表達特點及指導水稻高產優質育種生產提供理論參考。

關鍵詞：蔗糖轉運蛋白;基因表達;灌漿期;葉;穗;粳稻

中圖分類號：S511.01?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0056-06

水稻（Oryza sativa）是全球重要的糧食作物，世界上有一半的人口以水稻為主食[1-2]。隨著國家稻米市場的開放及人民生活水平的提高，近年來人們對粳米的需求量與日俱增，國內粳米供需矛盾突出[3]。2018年，全球粳米消費量較2010年增長了約6900萬t，增幅約為19%，全球粳米消費量占大米總消費量的比例由2010年的13%上升至2018年的14%。目前，我國仍為第一大粳米消費國，2018年的粳米消費量約為4200萬t，較2010年增加了約400萬t。因此，要保證粳米供給，必須擴大粳稻生產能力，突破粳稻品種選育滯后的問題，培育高產、抗逆的粳稻新品種[4]。高產優質粳稻品種的選育和生產離不開對粳稻遺傳和生理代謝等各方面的深入研究。

蔗糖轉運蛋白（sucrose transporter，簡稱SUT）是協調植物中碳素分配的重要分子，在植物各個生長階段的能量分配中起著至關重要的作用[5]。多個研究發現，SUTs基因之間通過相互協作或相互抑制來共同調節植物的生理代謝及生長發育[6]。研究發現，沉默馬鈴薯（Solanum tuberosum）StSUT4基因，StSUT1基因呈現出過表達現象，甚至導致馬鈴薯花期提前[7];對擬南芥（Arabidopsis thaliana）的AtSUT1基因進行過表達發現，AtSUT2、AtSUT4基因的表達量相對下降[8]。此外，SUTs基因與植物的抗逆性也緊密相關。在對擬南芥AtSUT9基因進行沉默處理后，發現擬南芥植株對鹽脅迫、滲透脅迫和低溫脅迫的抵抗能力顯著提高[9];對蘋果（Malus domestica）的MaSUT2基因進行過表達后，發現植株對鹽脅迫的抵抗力也明顯增強[10]。

目前，研究者在水稻中共鑒定出5個蔗糖轉運蛋白編碼基因（OsSUT1、OsSUT2、OsSUT3、OsSUT4、OsSUT5）[11]，其中對OsSUT1基因功能的研究較多，發現其在花粉發育、籽粒淀粉積累、灌漿速率、千粒質量等多個方面都起著非常重要的作用[12-13]。Miyazaki等研究發現，水稻耐熱品種Genkitsukushi（暫無中文名稱）在水稻抽穗期的莖、成熟期的種子中的OsSUT1基因表達量要明顯高于其他熱敏品種，說明此基因表達量的上調可以提高水稻對高溫脅迫的抗性[14]。OsSUT2基因在水稻籽粒灌漿的過程中對有機物的轉運起著重要作用，該基因突變會導致水稻農藝性狀發生變化，如分蘗數減少，株高、千粒質量及根部干質量明顯下降等，而其過表達會抑制OsSUT4基因的表達。此外，OsSUT2基因表達量的上調還可明顯增強植株的抗旱和抗鹽能力[15]。OsSUT3、OsSUT4和OsSUT5基因對穎果早期發育過程中的蔗糖轉運起著一定的作用[11]。從表達模式上看，OsSUT3優先在水稻花粉中表達，因此推測其可能影響花粉發育過程中的淀粉積累[12]。OsSUT5基因在庫組織中的表達量較高，與作物產量增加有關，抑制其表達會導致OsSUT1基因的表達量下調[16]。將OsSUT5基因轉入馬鈴薯中發現，馬鈴薯產量提高了1.9倍多，說明此基因還可以調節植物果實的生長發育[17]。

灌漿期是水稻生殖生長的一個重要環節，然而目前關于粳稻灌漿期OsSUTs基因表達特點的報道較少。本研究以云南農業大學稻作所保育的部分粳稻品種（系）為材料，通過分析粳稻品種（系）灌漿期OsSUTs基因在葉片、穗中的表達模式，為選育高優、穩產的粳稻品種及水稻碳水化合物在源庫流分配中的分子調控提供重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

粳稻材料共30份，均由云南農業大學稻作所保育。試驗材料種植于云南省宜良市云南農業大學稻作所試驗田，采用大田常規管理，同時取樣灌漿期的穗和綠色葉片，用液氮速凍后于-80 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取 參照天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取試劑盒說明書，用液氮預冷的鑷子取100 mg水稻材料放入1.5 mL離心管中，并在離心管中加入液氮，用滅菌的研磨棒將材料充分磨碎。研磨完畢后立即加入1 mL TRIzol，并振蕩混勻。將勻漿樣品在室溫下放置5 min，使核酸蛋白復合物完全分離，TRIzol、三氯甲烷的添加比例為1 mL ∶ 0.2 mL，蓋好管蓋后劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min，然后于4 ℃、12 000 r/min離心 15 min;將上層無色液體轉移到新的離心管中，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，然后于4 ℃、5 000 r/min離心 3 min。倒出上部液體，將剩余的少量液體于 5 000 r/min 離心10 s，然后用槍頭吸出液體，將帶有沉淀的離心管室溫放置約2～3 min，再加入30～60 μL RNas-Free ddH2O，以充分溶解RNA。

1.2.2 cDNA的合成 根據TaKaRa逆轉錄試劑盒進行cDNA的合成。第1步，在RNase-free的無菌PCR管中加入4 μL H2O（RNase free）、2 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gRNA Eraser和提取的 3 μL 總RNA，4 ℃、5 000 r/min離心5 s，于42 ℃恒溫 2 min，然后立即轉移到冰上降溫處理1 min;第2步，在新的RNase-free的PCR管中加入4 μL H2O（RNase free）、4 μL Prime Script Buffer、1 μL RT Prime Mix、1 μL Prime Script RT Enzyme Mix和10 μL 第1步的RNA混合液，然后將其置于37 ℃恒溫處理15 min，隨后于85 ℃處理5 s，取出后保存在-80 ℃，備用。

1.2.3 qRT-PCR 使用筆者所在課題組前期研究設計的5對OsSUTs基因的定量引物進行qRT-PCR試驗，OsSUTs基因和內參β-actin基因引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用SuperReal PreMix Plus[SYBR Green，天根生化科技（北京）有限公司]試劑盒及CFX96 Optical Reaction Module（美國伯樂公司）PCR儀進行實時定量PCR擴增。反應體系：12.5 μL 2×SuperReal PreMix Plus，1 μL cDNA，正、反向引物各1 μL，用RNase-free ddH2O補充總體積至25 μL。反應程序：95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，61 ℃ 1 min，40個循環。每個樣品獨立重復3次。

1.3 數據處理

數據在Excel軟件中采用2-△△CT法[18]進行分析，表達量數據圖的繪制及相關性分析采用GraphPadPrism 8.0軟件進行。

2 結果與分析

2.1 葉片和穗中OsSUTs基因在灌漿期的相對表達量

葉片的qRT-PCR結果表明，OsSUT2的相對表達量最高，達到28.464，其次為OsSUT4、OsSUT1、OsSUT5，OsSUT3的相對表達量最低，為0.002;與其他4個基因相比，OsSUT2的相對表達量是OsSUT1的28.464倍，OsSUT3的14 232倍，OsSUT4的3985倍，OsSUT5的9 488倍;OsSUT4的相對表達量雖居第2，但卻明顯高于OsSUT1、OsSUT3、OsSUT5，分別是它們的7.142、3 571、2 381倍;OsSUT1的相對表達量位列第3，是OsSUT3的500.0倍，OsSUT5的333.3倍;在5個基因中OsSUT5與OsSUT3的相對表達量最接近，OsSUT5的相對表達量僅為OsSUT3的1.5倍（圖1-A）。

穗部OsSUTs的相對表達量最高的也為OsSUT2，達49.068，其次為OsSUT4，最低的是OsSUT3，相對表達量為0.057;與其他4個基因相比，OsSUT2的相對表達量是OsSUT1的49.068倍，OsSUT3的860.842倍，OsSUT4的2.682倍，OsSUT5的9.640倍;穗部OsSUT4的相對表達量也是排在第2位，為OsSUT1的18.297倍，OsSUT5的3595倍;OsSUT5的相對表達量也較高，為OsSUT1的5090倍，OsSUT3的89.298倍，OsSUT4的相對表達量僅為OsSUT5的3595倍;與葉片中相似，OsSUT3的相對表達量最低，且與其他4個基因之間的差異極大（圖1-B）。

綜上可見，OsSUT2的相對表達量在葉片、穗部均為最高，OsSUT1、OsSUT4的相對表達量在葉片、穗部也都相對較高，并且排序也較一致，均為OsSUT2 > OsSUT4 > OsSUT1。在檢測的2個組織中，OsSUT3的相對表達量均為最低。有趣的是，OsSUT5在葉片中的相對表達量很低，但在穗部其相對表達量卻較葉片中有所提高，接近OsSUT2的10%，變化最明顯。

將葉片與穗部OsSUTs的相對表達量進行對比發現，由圖2可知，只有OsSUT1的相對表達量表現為葉片中高于穗部，前者約比后者高2.4倍，葉片中其余4個基因的相對表達量均低于穗部;OsSUT5的相對表達量在葉片與穗部中的差異最大，穗部中的相對表達量是葉片中的1 176.44倍;OsSUT3和OsSUT4的相對表達量在葉片中與穗中的差異也極明顯，穗部中OsSUT3的相對表達量是葉片中的108倍，穗部中OsSUT4的相對表達量是葉片中的11.9倍;OsSUT2在葉片中和穗部中的相對表達量相對穩定，穗部中OsSUT2的相對表達量較葉片中僅增加了1.15倍。

以上結果表明，在5個OsSUTs中，OsSUT1～4的表達量在葉片中和穗中差異明顯，OsSUT5的相對表達量在葉片和穗部中的差異很大。

2.2 OsSUTs相對表達量的相關性分析

由表1可以看出，在葉片中，OsSUT1的相對表達量與OsSUT2的相對表達量呈顯著正相關關系，與OsSUT3、OsSUT5的相對表達量呈極顯著正相關關系，但與OsSUT4的相對表達量無顯著相關性;

OsSUT2 的相對表達量只與 OsSUT1 的相對表達量呈顯著正相關關系，與其他3個基因的相對表達量無顯著相關性;OsSUT3的相對表達量與OsSUT1、OsSUT4、OsSUT5的相對表達量呈極顯著相關關系，且與OsSUT5相對表達量的相關性最高，與OsSUT2的相對表達量無顯著相關性;OsSUT4的相對表達量與OsSUT3、OsSUT5的相對表達量呈極顯著正相關關系，與OsSUT1、OsSUT2的相對表達量無顯著相關性;OsSUT5的相對表達量與OsSUT1、OsSUT3、OsSUT4的相對表達量呈極顯著相關關系，但與OsSUT2的相對表達量無顯著相關性。

由表1還可以看出，穗部OsSUT1的相對表達量與OsSUT2、OsSUT3、OsSUT4、OsSUT5的相對表達量呈極顯著正相關關系;OsSUT2的相對表達量與OsSUT1、OsSUT3、OsSUT4、OsSUT5的相對表達量呈極顯著正相關關系，且與OsSUT5相對表達量的相關性最高;OsSUT3的相對表達量與OsSUT1、OsSUT2、OsSUT4、OsSUT5的相對表達量呈極顯著正相關關系;OsSUT4的相對表達量與OsSUT1、OsSUT2、OsSUT3、OsSUT5的相對表達量呈極顯著正相關關系;OsSUT5的相對表達量與OsSUT1、OsSUT2、OsSUT3、OsSUT4的相對表達量呈極顯著正相關關系。

綜上可見，這5個OsSUTs在穗中的表達量相互間具有極顯著的相關性，但是OsSUTs的相對表達量在葉片和穗部間的相關性不顯著（表2）。

3 討論與結論

3.1 灌漿期OsSUTs基因在葉片中的表達特點

植物體中蔗糖轉運蛋白是具有蔗糖轉運活性的跨膜結構蛋白，在植物生長發育、生理代謝、蔗糖的運輸和分配過程中起著關鍵作用，還可以通過識別蔗糖信號影響其他代謝途徑[19]。目前，人們從水稻中共鑒定出5個OsSUT基因，其中OsSUT1主要在韌皮部裝載及同化物運輸過程中起關鍵作用[20]。OsSUT1是負責運輸蔗糖的關鍵基因，在籽粒灌漿期間，葉片產生的同化產物需要以蔗糖的形式通過韌皮部進行長距離運輸才能到達穗部，并且長距離運輸途徑并不集中在葉部，而是在整個植株中，因此OsSUT1在葉片中的表達量不會太高。本研究中，OsSUT1在灌漿期葉片中的表達量在5個OsSUT基因中處于中間水平，也能說明OsSUT1在灌漿期的葉片中并沒有較高表達量這一特點。OsSUT2主要在液泡膜上表達，并且在糖從源器官葉片輸出到庫器官的過程中扮演著重要角色，而在水稻灌漿期，葉片是光合作用的主要場所，其在灌漿期合成蔗糖的作用明顯增大，使得葉肉液泡中的蔗糖含量顯著增加[15]。本研究結果顯示，OsSUT2在灌漿期葉片中的表達量最高，說明OsSUT2在光合同化物的運輸和分配過程中起著舉足輕重的作用。有研究發現，OsSUT3在開花后20 d會降低到幾乎不能檢測的水平[11]。本研究發現，OsSUT3在灌漿期葉片中的表達量極低，說明OsSUT3在水稻灌漿階段的作用不明顯。在水稻的庫—源轉化過程中，OsSUT4在葉鞘中有較高的表達量[21]。本研究中，OsSUT4在葉片中的表達量較高，也可能說明OsSUT4對于葉片中的蔗糖轉運起著很重要的作用。有研究認為，OsSUT5主要參與蔗糖在組織和穎果中的卸載過程[22]，而本研究發現，OsSUT5在葉片中相對表達量較低，說明OsSUT5發揮作用的主要場所不在葉片中。

3.2 灌漿期OsSUTs基因在穗中的表達特點

籽粒充實是水稻高產的重要保障。Aoki等研究OsSUT1發現，在水稻庫組織中OsSUT1表達量很小[11]，這與Hirose等研究發現的在開花后的穗中幾乎檢測不到OsSUT1的表達[21]相似，這與本研究發現的OsSUT1在穗中表達量相對較低的結果也一致。研究發現，OsSUT2在水稻各組織中呈表達水平穩定趨勢[11]，并通過其在花后籽粒的表達模式，推斷出OsSUT2在籽粒的生長發育中起著主導作用，此外通過抑制OsSUT2的表達，從而造成源端光合作用合成的蔗糖不能及時有效地輸送到庫細胞中，從而造成源端大量積累蔗糖，籽粒蔗糖供應不充足，最終造成其生長遲緩，分蘗數、株高、千粒質量和根干質量顯著降低，結實率低，結實不飽滿及品質差等問題[15]。反之將OsSUT2進行過表達，發現其在抽穗后的表達量顯著高于普通植株OsSUT2的表達量，并且在灌漿期中有效地提高了光合產物的轉運和轉換，進而顯著地提高了水稻的單株粒質量及籽粒充實度[23]。這與本研究發現的葉與穗中OsSUT2的表達量都是穩定最高的結果相符，同時也表明了它對水稻產量確實有著重要的影響。他人研究發現，OsSUT3表達量有一定的波動性，在開花后1～2 d時達到最大，但在3 d時明顯下降，5～7 d又恢復，然后逐漸下降[24-25]。本研究中，灌漿期穗中的OsSUT3表達量極低，這可能說明OsSUT3在灌漿期行使的功能場所并不在穗中;OsSUT4在穎果等組織中有較強的表達[11]，這與本研究發現的OsSUT4在穗部的表達量較高的結果吻合。OsSUT5在花序及發育早期的穎果中能特異表達，其功能與籽粒的充實度和灌漿相關[26]，本研究中OsSUT5的表達量顯著增加與前人研究結果相同，這說明OsSUT5對水稻灌漿起著一定的作用。

3.3 葉穗間OsSUTs相對表達量的相關性

水稻葉片是蔗糖合成的重要產所，蔗糖從源到庫的轉運效率也尤為重要[27]。在水稻灌漿期間，葉片能為稻穗籽粒的充實提供合成有機物的源物質。因此，研究灌漿期葉和穗器官中OsSUTs基因表達的相關性可為探討光合同化物運輸、分配的代謝調控和水稻高產優質栽培提供理論參考。而在植物體的生長發育過程中，蔗糖轉運蛋白基因會在植物的不同組織、不同時期中協同調控植物體的生長過程，因此蔗糖轉運蛋白基因可能是單個特異的也可能是部分重疊的。本研究發現，多數OsSUTs基因的表達量在葉中不相關，這很可能跟OsSUTs特異性表達有關。比如OsSUT1與OsSUT5都是定位在質膜上的蔗糖轉運蛋白，但OsSUT5的特異性又比OsSUT1差[28]，與本研究相同的是OsSUT1與OsSUT5之間存在極顯著正相關關系，但相關性并不明顯。OsSUT2是定位在液泡中[15]，而液泡作為貯存和積累能量的細胞器，其主要功能是調節細胞滲透壓，因此OsSUT2與細胞膜上的OsSUT1、OsSUT5幾乎是無相關性。OsSUT3與OsSUT4功能尚不明確，但本研究發現，OsSUT3、OsSUT4與OsSUT5都呈極顯著相關關系且相關性較大，因此猜測OsSUT3與OsSUT4在葉片當中也起著一定作用，具體的機制有待下一步研究。

穗是水稻利用或貯存同化物的庫，有研究認為庫能刺激葉片中的光合活性，調節光合產物的分配[29]?；贠sSUTs基因在花后籽粒中的表達模式，可將籽粒發育分為2個階段，第1個階段為花后的1～4 d，為籽粒的生長及細胞分化階段;第2階段為花后5～15 d，為籽粒達到最長并開始增重階段[30]。由此可推測出OsSUT2、OsSUT4和OsSUT5在第1階段起主要作用，OsSUT1則在第2階段起作用，而OsSUT3則起著銜接這2個階段的作用[24]。與本研究的結果類似，在穗中，OsSUTs之間都呈極顯著正相關關系，證明這5個基因共同協調灌漿期的籽粒發育過程。此外，也有人認為，在開花期0～14 d，在水稻中過表達OsSUT2基因，OsSUT4的表達量明顯降低，為正常植株表達量的一半，表明OsSUT2基因的過表達可能會抑制OsSUT4的表達量[26]。而在本研究中，發現水稻灌漿期中的OsSUT2與OsSUT4基因呈正相關關系，這與上述結果相悖，猜測可能是植株本身會有一定的臨界值，在過表達植株上，OsSUT2大量表達可能會適得其反，造成其他基因表達量降低以及影響植株生長發育。OsSUT3、OsSUT4與OsSUT5在穗中呈極顯著正相關關系，且OsSUT5抑制表達會導致千粒質量降低，結實率降低[23]。由此猜測這幾個基因都與水稻的經濟產量有著緊密的關系。這也為OsSUT3與OsSUT4這2個基因功能的進一步研究提供了一定的參考價值。

葉片與穗部是水稻最主要的源與庫器官。而流則是源和庫之間的橋梁，流運行通暢會間接或者直接影響到源和庫的生理活性。前人研究發現，轉OsSUT2與OsSUT5會加快光合轉運速率，理論上其最終的堊白度應該高于對照，但結果是堊白度低于對照[23]。從這里可以猜測，從源中將光合產物轉運進庫中不僅僅依靠蔗糖轉運蛋白就能完成，在轉運的過程中，還需要細胞壁轉化酶[31-33]、單糖轉運蛋白[34]等共同配合完成，并且在灌漿期中籽粒淀粉的生物合成過程中還有大量的酶與蛋白質參與。而本研究只涉及蔗糖轉運蛋白基因，這也就說明了葉穗間OsSUTs并無相關性的原因。

綜上，在本研究中，OsSUT2無論在葉和穗中表達量都顯著高于其他4個基因，說明OsSUT2在灌漿期對蔗糖的轉運分配起著重要的作用。由于5個OsSUTs基因在穗中的表達量呈極顯著正相關關系，表明在穎果成熟階段這5個基因是協同表達的。本研究可為蔗糖轉運基因表達關系的進一步研究提供參考。

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