長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用

劉 佳，張 悅，沈志彥，張樹武，薛應鈺，梁巧蘭，陶 飛，徐秉良

(甘肅農業大學 植物保護學院/甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070)

美洲南瓜(Cucurbitapepo)為一年生蔓生草本植物，因其含有多種營養成分，具有很高的食用和藥用價值，在中國大部分地區普遍栽培[1]。甘肅省武威市是美洲南瓜的重要育種研發和生產基地，也是當地重要的經濟作物之一[2]。瓜類枯萎病(Fusariumwilt)是瓜類生產上最難防治的土傳性病害之一[3]，該病在大多數瓜類種植區均有發生，發病后會造成減產，甚至全田毀滅，且防治困難。因此，枯萎病的危害是瓜類生產上急需解決的重要問題，也成為限制美洲南瓜生產的重要因素之一[4]。

目前，對枯萎病的防治主要以化學防治為主，然而長期使用化學農藥容易造成農藥殘留，易使植株產生抗藥性，此外，還會危害人畜健康，造成環境污染等[5]。生物防治污染小、適用范圍廣，對環境干擾小，能夠有效抑制病原菌，這些特點與國家的綠色農業發展要求高度一致，近年來得到迅速推廣[6]。有研究表明，復配芽孢桿菌(解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens+枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis)具有很強的拮抗活性，能夠有效防治撐綠雜交竹枯萎病[7]。伊海靜等[8]研究表明，寡雄腐霉(Pythiumoligandrum)對草莓枯萎病菌具有很好的抑制效果。潘俊等[9]發現，熒光假單桿菌(Pseudomonasfluorescence)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的組合對石榴枯萎病有很好防治效果，而單用熒光假單桿菌(Pseudomonasfluorescence)的防治效果相對 較差。

瓜類枯萎病多為土傳病害，對土壤進行大面積的藥劑處理在生產中難以實現。因此，采用高效、安全、環境友好型生物制劑成為研究的熱點。有研究[10]表明：解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)Lh-1對西瓜枯萎病具有較好的防治效果。侯圓圓等[11]以綠針假單胞菌(Pseudomonaschlororaphis)G5菌株為生防因子來研究對瓜類枯萎病的防治。朱育菁等[12]研究表明,枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)NH-BS-2000對瓜類枯萎病同樣具有一定的防治效果。

木霉菌(Trichodermaspp.)作為一種具有重要開發價值的自然資源正逐漸被農業生物防治領域研究、開發和利用[13]。谷祖敏等[14]發現，將綠色木霉(Trichodermaviride)與菇渣和牛糞復配，不僅可以顯著提高木霉對黃瓜枯萎病的防病效果，而且對黃瓜生長具有促生作用。也有報道指出，添加少量營養元素為增效劑的木霉菌多功能生防菌劑、哈茨木霉菌Ta22(Trichodermaharzianira)和綠色木霉菌T23(Trichodermaviride)對甜瓜、黃瓜、西瓜枯萎病均具有很好的防治效果，防效均達到66%以上[15]。但是有關木霉菌對美洲南瓜枯萎病防治的研究報道較少。因此，本試驗對長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用及防治效果進行研究，為美洲南瓜枯萎病的生物防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病原菌 美洲南瓜枯萎病菌，從甘肅省武威市金蘋果有限責任公司種質資源試驗基地患枯萎病的美洲南瓜中采集，由甘肅農業大學植物保護學院植物病原學實驗室分離，并鑒定為尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)。

1.1.2 供試生防菌 具有自主知識產權的生防長枝木霉T6菌株(Trichodermalongibrachiatum，CGMCC.No.13183)，由甘肅農業大學植物保護學院植物病原學實驗室分離、保存。

1.1.3 供試培養基 PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。

PDB培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用 將長枝木霉T6菌株和美洲南瓜枯萎病菌活化，分別置于28 ℃恒溫培養箱培養。培養7 d后，在菌落最外層取直徑為5 mm的長枝木霉T6菌株菌餅，與美洲南瓜枯萎病菌菌餅對接于PDA培養基中，兩菌餅間隔3.5 cm[16]。以長枝木霉T6菌株純培養、美洲南瓜枯萎病菌純培養菌落作為對照，每組設立5個重復。置于 28 ℃的恒溫培養箱中培養7 d，定期觀察兩種菌的生長情況，觀察并記錄其生長半徑。

菌絲生長抑菌率=(美洲南瓜枯萎病菌菌落直徑-木霉處理菌落直徑)/美洲南瓜枯萎病菌菌落直徑×100%

1.2.2 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌拮抗作用方式觀察 在PDA培養基中央放置一塊20 mm×20 mm的無菌蓋玻片，在無菌蓋玻片左右兩側20 mm處分別接種長枝木霉T6菌株和美洲南瓜枯萎病菌，設置12個重復。將接種好的培養皿放置在28 ℃恒溫培養箱中培養，培養 3 d時，取下蓋玻片，放在載玻片上，用光學顯微鏡觀察兩種菌菌絲之間的作用方式，并分別用照相機(Canon 100D)和生物顯微成像分析系統(Nikon E200-2MV-U2)拍照。

1.2.3 長枝木霉T6菌株發酵液對美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌發的影響 將長枝木霉T6菌株發酵液與制備好的美洲南瓜枯萎病菌分生孢子懸浮液(濃度為1×105cfu·mL-1)[17]按1∶1的比例混勻，取60 μL滴于PDA平板上，均勻涂布，以無菌水與分生孢子懸浮液混合處理作為空白對照，每組設置5個重復，置于28 ℃的恒溫培養箱中培養，分別于6 h、12 h、18 h、24 h統計分生孢子萌發率。

孢子萌發抑制率=(1-孢子萌發數)/孢子總數×100%

1.2.4 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病的室內防效試驗 在玻璃培養皿(直徑9 cm)中鋪3層滅菌濾紙，用移液器均勻滴加3 mL無菌水于濾紙上，至濾紙浸濕無多余水，分別用75%酒精2 min和3%次氯酸鈉5～10 min將美洲南瓜(品種為‘光板’)的種子浸泡消毒，無菌水沖洗后均勻擺在鋪好的濾紙上，把培養皿放于 25 ℃、16 h光照、8 h黑暗的恒溫培養箱中培養約 7 d。待種子長出1 cm左右長的根后，置于裝有滅菌營養土的盆中種植培養。

待培養至4～5葉苗齡時期后，選取長勢一致的美洲南瓜苗，將植株根部從花盆中挖出，沖洗干凈，用無菌濾紙將水分吸干后用無菌剪刀將植株須根剪掉0.2 cm，造成傷口。利用蘸根法[18]，將植株根部全部浸泡在配置好的美洲南瓜枯萎病菌孢子懸浮液(濃度為1×105cfu·mL-1)中30 min[19]。選取一部分接種病原菌的美洲南瓜苗，培養1 d，灌入配置好的長枝木霉T6菌株孢子懸浮液，以無菌水作為對照，處理后美洲南瓜苗重新種進花盆中。培養5 d后，觀察并記錄3組美洲南瓜苗生長及發病情況。每個處理20株，重復3次。

發病率=發病植株數/調查總株數×100%

病情指數=∑(各級病株數×各級代表值)/(調查總株數×最高級代表值)×100

病情分級標準為[20]：0級，無病癥；1級，子葉萎蔫或部分子葉與真葉輕微萎蔫；2級，1片真葉萎蔫或子葉較重萎蔫；3級，子葉及部分真葉萎蔫；4級，整株輕度萎蔫，部分枯死，但是心葉仍然成活；5級，整株嚴重萎蔫并枯死。

1.2.5 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜種子胚根發病的影響 在玻璃培養皿(直徑18 cm)中鋪3層滅菌紗布，用移液器均勻滴加3 mL無菌水于濾紙上，選取大小、長勢一致的美洲南瓜種子均勻擺在濾紙上，把培養皿置于16 h光照、8 h黑暗的25 ℃恒溫培養箱中培養3 d。待種子長出胚根后用滅菌的接種針將種子的胚根部表皮輕輕扎破，造成微傷口，在傷口處多次噴美洲南瓜枯萎病菌孢子懸浮液(濃度為1×105cfu·mL-1)，恒溫培養箱中培養。選取一部分接種病原菌的種子，培養1 d后，在傷口處多次噴長枝木霉T6菌株孢子懸浮液，同樣繼續放在恒溫培養箱中培養。對照組同樣刺傷，以無菌水處理，觀察并記錄種子根系的發病情況。每個處理20粒種子，重復3次。

1.3 數據統計與分析

試驗數據利用Microsoft Excel 2010整理，采用SPSS 16.0統計分析軟件對數據進行方差分析并做差異顯著性檢驗(Duncan氏新復極差法)。

2 結果與分析

2.1 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用及方式觀察

在對峙培養中，長枝木霉T6菌株生長速度較快，覆蓋了平板的4/5，表明長枝木霉T6菌株在空間和營養上有明顯的競爭優勢。和美洲南瓜枯萎病菌的純培養相比，與長枝木霉T6菌株對峙培養的美洲南瓜枯萎病菌生長活力低下，僅形成較小菌落(圖1)，經測量計算得知，長枝木霉T6菌株對南瓜枯萎病菌的抑制率為60.09% (表1)。

長枝木霉T6菌株菌落與美洲南瓜枯萎病菌菌落之間形成明顯的抑菌帶，說明長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌具有明顯抑制作用(圖2-A)；顯微鏡下觀察發現長枝木霉T6菌株菌絲已經對美洲南瓜枯萎病菌菌絲發生纏繞(圖2-B)，表明長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌有重寄生作用。

A.長枝木霉T6菌株與美洲南瓜枯萎病菌的平板對峙；B.美洲南瓜枯萎病菌純培養

表1 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用Table 1 Inhibition of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on Fusarium oxysporum

2.2 長枝木霉T6菌株發酵液對美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌發的影響

由表2可知，長枝木霉T6菌株發酵液對美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌發具有明顯的抑制作用。當長枝木霉T6菌株發酵液處理24 h后，分生孢子萌發率僅為31.00%，與對照相比，萌發率下降63.10%(P<0.05)。

表2 長枝木霉T6菌株發酵液對美洲南瓜枯萎病菌分生孢子萌發的影響Table 2 Conidia germination of Fusarium oxysporum under treatment of fermentation broth of Trichoderma longibrachiatum T6 strain

2.3 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病的室內防效

如圖3-A所示，無菌水處理的美洲南瓜苗生長健康，莖稈有力，葉片舒展肥大；接種病原菌的美洲南瓜苗全部萎蔫倒伏，莖基部變黃萎縮，葉片皺縮變褐(圖3-B)；接種病原菌后用長枝木霉T6菌株處理的美洲南瓜苗發病情況得到改善，葉片漸漸舒展(圖3-C)。

長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病的室內防效結果表明，長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病發病率具有明顯的抑制作用，接種病原菌的美洲南瓜苗的發病率高達72.06%，經過長枝木霉T6菌株處理的美洲南瓜苗，發病率降至 28.36%，比對照組下降60.6%；接種病原菌的美洲南瓜苗病情指數高達69.33，處理組的病情指數低至21.45；通過試驗得知，長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病具有一定的防治效果，防效達到69.06%(表3)。

A.病原菌與生防菌間出現明顯抑菌帶；B.長枝木霉T6菌株菌絲纏繞在美洲南瓜枯萎病菌上生長(a為長枝木霉T6菌株菌絲；b為美洲南瓜枯萎病菌菌絲)

2.4 長枝木霉T6菌株對美洲南瓜種子催芽的影響

美洲南瓜種子未接種病菌時，種子根部和莖基部顏色白，較粗壯，根長且健康(圖4-A)；接菌后，種子根部和莖基部變黃、萎縮，且生長緩慢甚至停止生長(圖4-B)；接菌后又經過長枝木霉T6菌株處理的種子根部和莖基部變白，變粗壯，恢復生長活力(圖4-C)。

A.健康美洲南瓜種子；B.接種病原菌的美洲南瓜種子； C.發病后經長枝木霉T6菌株處理的美洲南瓜種子

3 結論與討論

李琳等[21]從胡麻種植土壤中分離出一種SF1生防菌，其對尖孢鐮孢菌胡麻專化型真菌的抑菌率達58.99%。劉彩云等[22]研究表明，生防菌LB-1發酵液葉面噴施盆栽苗和浸蘸處理離體葉段，對煙草白粉病的防效和抑制率分別為 44.90%和53.11%。本研究表明，生防菌長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑菌率可達 60.09%，對美洲南瓜枯萎病菌分生孢子的萌發率抑制率達到31.00%。侯仙等[23]采用菌液灌根的方法測定生防菌NJZ12-2對棉花黃萎病的室內盆栽防治效果為52.41%～52.81%，本研究同樣采用蘸根法測定長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病的室內盆栽防效，防效達到69.06%，表明長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病有較好的防治效果。

據報道，拮抗木霉菌的生防機制包括重寄生作用、抗生作用、競爭作用、誘導抗病性、促生作用和協同拮抗作用[24]。郎劍鋒等[25]研究表明，哈茨木霉對小麥紋枯病的生防機制表現為營養競爭、抗生和重寄生作用。本研究亦得到一致的結論，長枝木霉T6菌株生長速度快，快速占領空間，奪取病原菌的營養，阻礙病原菌的生長，顯微觀察發現，長枝木霉T6木霉的菌絲纏繞在美洲南瓜枯萎病菌的菌絲上，吸取菌絲內的營養物質，分解病原菌，表現為重寄生作用。

本研究結果表明，長枝木霉T6菌株通過競爭空間，養分及菌絲纏繞美洲南瓜枯萎病菌菌絲，達到對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用，同時長枝木霉T6菌株發酵液對該病菌的分生孢子萌發亦具有明顯的抑制作用；室內盆栽試驗證實長枝木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病的防效達到 69.06%。該研究結果為美洲南瓜枯萎病菌的生防制劑篩選提供一定的理論基礎。