氈毛馬蘭酚性成分及其抗腫瘤活性

黃宇飛 張 楠 周忠玉楊家欣劉勁松王國凱*

（1.安徽中醫藥大學藥學院，中藥與開發安徽省重點實驗室，安徽合肥 230012；2.安徽省中醫藥科學院藥物化學研究所，安徽合肥 230012；3.中國科學院華南植物園，中國科學院植物資源保護與可持續利用重點實驗室，廣東廣州 510650；4.臺灣中國醫藥大學附設醫院醫學研究部，臺灣臺中40447）

氈毛馬蘭Kalimeris shimadae（Kitam.）Kitam.為菊科馬蘭屬的一種多年生草本植物,有根狀莖,別名島田馬蘭、氈毛雞兒腸等。產于安徽、浙江、福建、臺灣、江蘇南部、江西南部、湖北及湖南北部等,生于林緣、草坡或溪岸等。可用于清熱解毒、利尿、涼血、止血,也用于目赤［1］。本課題組近十多年一直從事馬蘭屬相關研究,分離并鑒定了三萜、黃酮、酚酸類等多種成分［2-8］。本實驗對氈毛馬蘭進行化學成分研究,從中分離鑒定了12個酚性化合物,且所有化合物均為首次從該植物中分離得到。化合物6、8對8種腫瘤細胞有一定的細胞毒活性。

1 材料

Waters AutoSpec Premier P776質譜儀（美國Waters公司）；Bruker AV-400和DRX-500核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；Agilent 1100型和1260型HPLC （美國Agilent公司）；柱層析硅膠（200～300目）、GF254硅膠板（青島海洋化工廠）；RP-18反相填料（40～75 μm,日本富士公司）；Sephadex LH-20為（瑞典GE公司）；色譜純試劑（德國默克公司）；其他試劑均為分析純。

氈毛馬蘭藥材于2016年7月采集于安徽合肥市少荃湖,經安徽中醫藥大學楊青山老師鑒定為菊科馬蘭屬氈毛馬蘭Kalimeris shimadae（Kitam.）Kitam.干燥全草。憑證標本（201601）保存于安徽中醫藥大學藥學院天然藥物化學研究室。

2 提取與分離

干燥藥材20 kg,80%乙醇回流提取3次,每次2 h,合并提取液,減壓濃縮得到3.2 kg流浸膏。經硅膠柱二氯甲烷-甲醇（100 ∶0～0 ∶100）梯度洗脫,得11個組分（L1-L11）。

組分L5經硅膠柱石油醚-丙酮 （100 ∶ 0、50 ∶1、10 ∶1、1 ∶1）梯度洗脫,得5個亞組分L5.1～L5.5,組分L5.4經硅膠柱二氯甲烷-甲醇（100 ∶0、50 ∶1、30 ∶1、10 ∶1、1 ∶1）梯度洗脫,得4個亞組分L5.4.1～L5.4.4,組分L5.4.2經反相Rp-18柱甲醇-水（25 ∶75～100 ∶0）梯度洗脫,得10個亞組分L5.4.2.1～L5.4.2.10,組分L5.4.2.2經凝膠柱氯仿-甲醇 （1 ∶ 1）和制備HPLC乙腈-水（5 ∶95～25 ∶75）純化得化合物1（5.2 mg）；組分L5.4.2.3經凝膠柱（甲醇）色譜和制備HPLC乙腈-水（8 ∶92～8 ∶92）純化得化合物2 （8.4 mg）；組分L5.4.3.1.3析出無色針狀結晶,經反復重結晶并經凝膠柱（丙酮）色譜純化得化合物5 （3.5 mg）。組分L5.4.3.1.7析出黃色針狀結晶,經反復重結晶得化合物12 （33.5 mg）。組分L5.4.3.2經凝膠柱（甲醇）色譜分離得4個亞 組 分 L5.4.3.2.1～ L5.4.3.2.4,組 分L5.4.3.2.2經制備HPLC乙腈-水（12 ∶88～12 ∶88）純化得化合物9 （8.5 mg）；組分L5.4.3.2.3經制備HPLC乙腈-水（12 ∶88～32 ∶68）純化得化合物8 （2.5 mg）；組分L5.4.3.2.4經硅膠柱石油醚-丙酮（15 ∶1～1 ∶1）梯度洗脫分離得化合物6 （3.4 mg）、7 （15.5 mg）。組分L5.4.3.3析出無色針狀結晶,經反復重結晶和制備HPLC乙腈-水（15 ∶85～30 ∶70）純化得化合物3 （16.5 mg）；組分L5.4.3.3母液經硅膠柱色譜石油醚-丙酮（5 ∶1）洗脫,經凝膠柱（丙酮）色譜純化得化合物4（1.8 mg）。組分L6經反相Rp-18中壓柱色譜甲醇-水（20 ∶80～100 ∶0）梯度洗脫分離得26個亞組分L6.1～L6.26。組分L6.4硅膠柱色譜石油醚-丙酮（10 ∶1～8 ∶1）梯度洗脫得4個亞組分L6.4.1～L6.4.4,組分L6.4.2經制備HPLC乙腈-水（10 ∶90～30 ∶70）純化得化合物10 （4.9 mg）；組分L6.4.4經制備HPLC乙腈-水（5 ∶95～20 ∶80）純化得化合物11 （6.6 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：紫色粉末,易溶于甲醇,ESI-MS m/z：151.2 ［M-H］-。1H-NMR （400 MHz,CD3OD）δ：9.71 （1H,s,-CHO）,7.41 （1H,brd,H-6）,7.40 （1H,brs,H-2）,6.92 （1H,d,J=8.5 Hz,H-5）,4.95 （1H,brs,-OH）,3.89 （3H,s,-OCH3）；13C-NMR （100 MHz,CD3OD） δ：129.1 （C-1）,115.0 （C-2）,153.5 （C-3）,148.3 （C-4）,109.9（C-5）,126.6 （C-6）,191.5 （-CHO）,55.0 （-OCH3）。以上數據與文獻［9］基本一致,故鑒定為香草醛。

化合物2：淡紫色針狀結晶,易溶于氯仿,ESI-MS m/z：181.1 ［M-H］-。1H-NMR （400 MHz,CDCl3） δ：9.81 （1H,s,-CHO）,7.14 （2H,s,H-2,6）,6.13 （1H,s,-OH）,3.96 （6H,s,3,5-OCH3）；13C-NMR （125 MHz,CDCl3） δ：128.4 （C-1）,106.7 （C-2,C-6）,147.4 （C-3,C-5）,140.8（C-4）,190.8 （-CHO）,56.5 （3,5-OCH3）。以上數據與文獻［10］基本一致,故鑒定為丁香醛。

化合物3：無色針狀結晶,易溶于甲醇,ESIMS m/z：193.0 ［M-H］-。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.58 （1H,d,J=16.2 Hz,β-H）,7.12（1H,H-2）,7.03 （1H,H-6）,6.81 （1H,d,J=8.0 Hz,H-5）,6.30 （1H,d,J=15.7 Hz,α-H）,3.86 （3H,s,3-OCH3）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：127.8 （C-1）,116.0 （C-2）,149.3 （C-3）,150.3 （C-4）,116.5 （C-5）,124.0 （C-6）,147.0 （C-α）,111.7 （C-β）,171.3 （-C=O）,56.5（-OCH3）。以上數據與文獻［11］基本一致,故鑒定為阿魏酸。

化合物4：淡黃色油狀物,易溶于甲醇,ESIMS m/z：319.1 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.61 （1H,dd,J=8.4,1.9 Hz,H-4″）,7.56 （1H,H-6″）,6.89 （1H,d,J=1.5 Hz,H-2′）,6.80 （1H,d,J=8.2 Hz,H-3″）,6.76 （1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6′）,6.72 （1H,d,J=8.2 Hz,H-5′）,4.75 （1H,dd,J=8.7,5.2 Hz,H-2）,4.25 （1H,dd,J=10.6,8.9 Hz,H-1b）,3.86（3H,s,5″-OCH3）,3.82 （3H,s,3′-OCH3）,3.71（1H,dd,J=10.6,5.1 Hz,H-1a）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：65.5 （C-1）,129.8 （C-1′）,130.4 （C-1″）,56.3 （C-2）,112.7 （C-2′）,153.1（C-2″）,199.6 （C-3）,149.3 （C-3′）,115.7 （C-3″）,147.0 （C-4′）,125.2 （C-4″）,116.4 （C-5′）,148.9 （C-5″）,122.2 （C-6′）,112.5 （C-6″）,56.4（3′-OCH3）,56.3 （5″-OCH3）。以上數據與文獻［12］基本一致,故鑒定為2-（4-羥基-3-甲氧基）-3-（2-羥基-5-甲氧基）-3-氧-1-丙醇。

化合物5：無色針狀結晶,易溶于氯仿,ESIMS m/z：445.2 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CDCl3） δ：7.71 （2H,d,J=7.0 Hz,H-2′）,7.53（1H,t,J=7.2 Hz,H-4′）,7.44 （2H,t,J=7.4 Hz,H-3′）,7.26 （5H,m,H-2?～6?）,7.15 （2H,m,H-3″,4″）,6.76 （1H,d,J=7.6 Hz,H-β）,5.99 （1H,d,J=8.7 Hz,H-α）,4.77 （1H,m,H-3）,4.34 （1H,m,H-1）,3.93 （1H,dd,J=11.3,4.6 Hz,H-2a）,3.82 （1H,dd,J=11.3,4.0 Hz,H-2b）,3.24 （1H,dd,J=13.9,6.0 Hz,H-8a）,3.06 （1H,dd,J=13.5,8.3 Hz,H-8b）,2.75（2H,m,H-9）,2.02 （3H,s,H-7）；13C-NMR（125 MHz,CDCl3） δ：49.4 （C-1）,64.6 （C-2）,55.0 （C-3）,170.2 （C-4）,167.1 （C-5）,170.8（C-6）,20.8 （C-7）,38.4 （C-8）,37.4 （C-9）,133.6 （C-1′）,127.1 （C-2′）,128.7 （C-3′）,131.9（C-4′）,136.6 （C-1″）,129.1 （C-2″）,128.6 （C-3″）,126.8 （C-4″）,136.6 （C-1?）,129.3 （C-2?）,128.8 （C-3?）,127.2 （H-4?）。以上數據與文獻［13］基本一致,故鑒定為金色酰胺醇乙酸酯。

化合物6：淡黃色針狀結晶,易溶于甲醇,ESI-MS m/z：137.0 ［M-H］-。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.77 （2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6）,6.91 （2H,d,J=8.6 Hz,H-3,5）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：122.9 （C-1）,131.7 （C-2,6）,115.2.（C-3,5）,163.7 （C-4）,169.1 （-COOH）。以上數據與文獻［14］基本一致,故鑒定為對羥基苯甲酸。

化合物7：白色粉末,易溶于甲醇,ESI-MS m/z：199.1 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.32 （2H,s,H-2,6）,3.88 （6H,s,3,5-OCH3）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：120.5 （C-1）,106.9 （C-2,6）,147.4 （C-3,5）,140.3 （C-4）,168.6 （-COOH）,55.4 （3,5-OCH3）。以上數據與文獻［15］基本一致,故鑒定為丁香酸。

化合物8：白色粉末,易溶于甲醇,ESI-MS m/z：123.0 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：9.76 （1H,s,-CHO）,7.77 （2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6）,6.91 （2H,d,J=8.7 Hz,H-3,5）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：130.1 （C-1）,132.6 （C-2,6）,116.4 （C-3,5）,161.8 （C-4）,191.1 （-CHO）。以上數據與文獻［16］基本一致,故鑒定為對羥基苯甲醛。

化合物9：白色針狀結晶,易溶于甲醇,ESIMS m/z：227.1 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.31 （2H,s,H-3,5）,3.95 （2H,m,H-9）,3.90 （6H,s,2,6-OCH3）,3.18 （2H,m,H-8）；13C-NMR （100 MHz,CD3OD） δ：129.2 （C-1）,149.0 （C-2,6）,107.3 （C-3,5）,142.6 （C-4）,199.7 （C-7）,41.7 （C-8）,58.9 （C-9）,56.9（2,6-OCH3）。以上數據與文獻［17］基本一致,故鑒定為3-羥基-1-（4-羥基-3,5-二甲氧苯基）-1-丙酮。

化合物10：淡黃色油狀物,易溶于甲醇,ESIMS m/z：137.1 ［M-H］-。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.03 （2H,d,J=8.5 Hz,H-2,6）,6.70 （2H,d,J=8.5 Hz,H-3,5）,3.68 （2H,t,J=7.1 Hz,H-8）,2.71 （2H,t,J=7.1 Hz,H-7）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：130.9 （C-1）,130.7 （C-2,6）,115.9 （C-3,5）,155.8 （C-4）,39.0 （C-7）,63.9 （C-8）。以上數據與文獻［18］基本一致,故鑒定為對羥基苯乙醇。

化合物11：白色針狀結晶,易溶于甲醇,ESIMS m/z：243.1 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CD3OD） δ：7.35 （2H,d,J=3.9 Hz,H-2′,6′）,5.14 （1H,d,J=3.8 Hz,H-2）,3.75 （1H,m,H-3b）；13C-NMR （125 MHz,CD3OD） δ：199.6 （C-1）,75.5 （C-2）,66.3 （C-3）,107.7 （C-2′,6′）,149.2 （C-3′,5′）,56.9 （3′,5′-OCH3）。以上數據與文獻［19］基本一致,故鑒定為2,3-二羥基-1-（4-羥基-3,5-二甲氧苯基）-1-丙酮。

化合物12：黃色針狀結晶,微溶于甲醇、丙酮,ESI-MS m/z：347.1 ［M+H］+。1H-NMR （400 MHz,CDCl3） δ：12.76 （1H,s,5-OH）,7.88 （2H,d,J=8 .9 Hz,H-2′,6′）,7.03 （2H,d,J=8.7 Hz,H-3′,5′）,6.58 （1H,s,H-3）,4.03 （3H,s,6-OCH3）,4.01 （3H,s,8-OCH3）,3.89 （3H,s,4′-OCH3）；13C-NMR （125 MHz,CDCl3） δ：163.8（C-2）,103.7 （C-3）,183.0 （C-4）,162.7 （C-4′）,55.6 （4′-OCH3）,148.4 （C-5）,130.7 （C-6）,61.9（6-OCH3）,148.8 （C-7）,128.1 （C-8）,61.0 （8-OCH3）145.8 （C-9）,104.6 （C-10）,123.5 （C-1′）,127.4 （C-2′,6′）,114.6 （C-3′,5′）。以上數據與文獻［20］一致,故鑒定為5,7-二羥基-4′,6,8-三甲氧基黃酮。

4 抗腫瘤活性

采用MTT法［7］測定化合物6、8分別對8種腫瘤細胞株,包括Cal27、SCC-4、SCC-9、HSC-3 4種口腔癌細胞株、A549、H460 2種肺癌細胞株以及HT29、Colo205 2種結腸癌細胞株（臺灣中國醫藥大學附設醫院提供）的細胞存活率。將化合物6、8分別制備成0、1、10、20 μmol/L的濃度作為加藥組,同時采用紫杉醇 （0、0.1、0.5、1 μmol/L）作陽性對照藥,同時設置空白對照組,先將癌細胞（10 000/孔）分別接種于96孔板,每孔100 μL,加入上述不同濃度化合物6、8,以及陽性對照藥組,孵育20 h后,加入5 mg/mL每孔的MTT 10 μL,繼續培養4 h后棄去上清液,每孔再加入100 μL DMSO溶解,490 nm測定吸光度。腫瘤細胞存活率是加藥組與空白組比較,細胞存活率=（OD加藥組）/ （OD空白組）×100%,抑制率=（1-存活率）×100%,IC50由抑制率通過Graphpad軟件進行擬合計算所得。化合物6、8分別對8種腫瘤細胞株的IC50值見表1,結果表明化合物6、8對腫瘤細胞具有一定的抑制作用。

表1 各化合物抗腫瘤細胞IC50值（，μmol/L）Tab.1 IC50values of various compounds on cancer cells （，μmol/L）

表1 各化合物抗腫瘤細胞IC50值（，μmol/L）Tab.1 IC50values of various compounds on cancer cells （，μmol/L）

5 討論

氈毛馬蘭為菊科馬蘭屬草本植物,關于其研究報道較少。本課題組多年從事馬蘭屬植物的相關研究,前期研究結果表明酚性成分是其重要的一類成分。本研究從中分離鑒定了12個酚性化合物,且所有化合物均為首次從該植物中分離得到,其中,阿魏酸具有降血脂、抗氧化、抗菌消炎、抗突變、防癌等作用［21］。丁香酸具有抗鼻咽癌CNE-1細胞株和CNE-2細胞株活性［22］。抗腫瘤活性實驗結果顯示化合物6、8對8種腫瘤細胞有抑制其生長活性的作用,以期為氈毛馬蘭藥效物質基礎的深入研究提供參考。