膈下逐瘀湯對慢性盆腔炎大鼠TLR4/NF-κB信號的影響

姚春娣，朱澄漪，溫 玲，郁金芬，蔣志濤

（南京中醫藥大學附屬張家港醫院，江蘇張家港 215600）

盆腔炎性疾病 （pelvic inflammatory disease,PID）是指女性上生殖道及其周圍組織的一組感染性疾病,主要包括子宮內膜炎、輸卵管炎、輸卵管卵巢膿腫、盆腔腹膜炎等［1］。慢性盆腔炎（chronicpelvic inflammatory disease,CPID）是指盆腔炎性疾病未得到及時正確的治療而繼發的一系列后遺癥,故又稱為盆腔炎性疾病后遺癥,其主要臨床表現為反復發作的盆腔疼痛、腰骶酸痛、痛經等,如不及時治療,易導致不孕不育、異位妊娠等［1-2］。慢性盆腔炎是臨床常見病、多發病,也是遷延不愈的疑難病。由于慢性盆腔炎病程長,易復發,嚴重影響著女性的身心健康,是臨床上亟待解決的一大婦科難題,截止至目前,西醫對此沒有理想的治療藥物和方法,中醫藥對慢性盆腔炎有獨特的治法治則和獨到的療效,而且不會產生明顯的耐藥現象。

膈下逐瘀湯來源于清代王清任的 《醫林改錯》,是歷代醫家治療氣滯血瘀型慢性盆腔炎及痛經的經典名方。全方由當歸、川芎、赤芍等藥味組成,具有活血化瘀、行氣止痛之效,對慢性盆腔炎氣滯血瘀證有顯著療效［3］。臨床與藥理研究已證實,膈下逐瘀湯對慢性盆腔炎療效確切,可改善患者血液流變學,抑制患者TNF-α 水平［4-5］,但其機制仍不清楚。本研究探討膈下逐瘀湯是否可通過調控TLR4/NF-κB信號抑制慢性盆腔炎模型大鼠炎癥,改善其血液流變學參數,以期為該方用于婦科炎性疾病的治療提供科學依據。

1 材料

1.1 動物 50只SPF級SD雌性大鼠,8周,體質量180～220 g,購自南京青龍山動物養殖場,使用許可證號SYXK （蘇）2017-0001。自由飲水飲食,室溫（22±1）℃,保持12 h晝夜交替。

1.2 藥物與試劑 膈下逐瘀湯由川芎12 g、桃仁9 g、丹皮9 g、赤芍9 g、紅花6 g、烏藥9 g、延胡索12 g、五靈脂6 g、當歸15 g、香附9 g、枳殼6 g、甘草6 g組成,上述飲片均購自蘇州市天靈中藥飲片有限公司（批號分別為170606、171106、170925、170812、170908、170521、170412、170718,170408、170723、170628、170508）,上述飲片經張家港市中醫醫院余輝主任中藥師鑒定為正品,按處方比例取膈下逐瘀湯各藥味適量,加水煎煮2次,每次1 h,合并煎液,濃縮至每1 mL相當于2 g飲片的流浸膏（2.0 g/mL）,備用,各味藥材由蘇州市天靈中藥飲片有限公司提供,經張家港市中醫醫院余輝主任中藥師鑒定均符合要求。大鼠IL-1β ELISA檢測試劑盒 （英國Abcam公司,貨號ab100768）；大鼠IL-6 ELISA檢測試劑盒 （英國Abcam公司,貨號ab100772）；大鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒（英國Abcam公司,貨號ab100785）；TLR4抗體 （英國Abcam公司,貨號ab22048）；NF-κB p65 （phospho S536）抗體（英國Abcam公司,貨號ab86299）；β-actin抗體（英國Abcam公司,貨號ab8227）；HRP-山羊抗兔IGg （英國Abcam公司,貨號ab6721）；DAB顯色試劑盒（碧云天生物技術有限公司,貨號P0203）；其他試劑為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 儀器 BSA124S分析天平（德國塞多利斯科儀器有限公司）；MicroCL17R高速低溫離心機（美國賽默飛世爾科技公司）；LB-2A系列全自動血流變分析儀（天津市唐宇醫療器械科技發展有限公司）；DMI3000B光學顯微鏡 （德國萊卡公司）；ELx800酶標儀 （美國伯騰儀器有限公司）；EG1160石蠟包埋機（德國萊卡公司）；RM201石蠟切片機（德國萊卡公司）；ABI 7500實時熒光定量PCR系統（美國ABI公司）。

2 方法

2.1 慢性盆腔炎大鼠模型的建立 各組大鼠腹部常規消毒后用10% 水合氯醛腹腔注射麻醉（350 mg/kg）,仰臥位固定后,腹部用碘伏消毒,下腹部正中切口約2 cm,暴露子宮,除假手術組外,用1 mL注射器在子宮分岔處分別向左右兩側卵巢方向緩慢注入25%苯酚膠漿0.06 mL,假手術組,注入0.06 mL生理鹽水。注畢,分層縫合傷口,消毒手術區域。

2.2 分組與給藥 50只SPF級成年未孕SD雌性大鼠,適應性飼養后,隨機分為假手術組、模型對照組及膈下逐瘀湯低、中、高劑量組,每組10只。采用苯酚膠漿法復制慢性盆腔炎大鼠模型,造模1周后,各治療組灌胃給藥3周,治療組大鼠給予膈下逐瘀湯流浸膏 （低、中、高劑量分別為2.5、12.5、25 g生藥/kg）,1次/d,連續21 d,假手術組和模型對照組同步灌胃給予等容量生理鹽水。

2.3 標本采集 給藥治療結束后（前1天禁食不禁水）,麻醉大鼠后,頸部主動脈采血,分別用血清管及肝素抗凝管收取全血,取部分肝素抗凝管中的全血分離血漿,用于檢測血漿黏度,其余抗凝全血用于血液流變學檢測,血清管中分離血清用于檢測炎癥因子。剖開大鼠腹腔,取雙側子宮,一側組織于10%中性甲醛中固定,于4 ℃保存,用于HE染色和免疫組化檢測；另一側組織置于凍存管中,標號后存于-80 ℃超低溫冰箱中,用于RT-PCR檢測。

2.4 血液流變學檢測 使用天津市唐宇醫療器LB-2A系列全自動血流變分析儀測定各組大鼠血液流變學指標。檢測在高切、中切、低切變率下各組大鼠的全血黏度及血漿黏度。

2.5 炎癥因子檢測 使用購買的大鼠IL-1、IL-6及TNF-αELISA檢測試劑盒,檢測大鼠血清中炎癥因子的水平。參考各個試劑盒的說明書對標準品和樣本進行稀釋,并將不同濃度的標準品和待檢測樣品分別加入包被了不同抗體的96孔檢測板中,重復反應后,加入對應試劑盒中的顯色底物,顯色后加入反應終止液。將96孔板置于酶標儀中,450 nm波長檢測各板的吸光度值,根據不同濃度標準品的吸光度值繪制標準曲線,根據標準曲線計算各大鼠血清中IL-1、IL-6及TNF-α 的水平。

2.6 HE染色 取固定于10%福爾馬林的各組大鼠子宮,垂直切取一段放于一次性包埋框中使用不同濃度的乙醇進行梯度脫水。脫水后,將子宮浸泡于二甲苯中30 min,之后將子宮放于融化的石蠟中1 h,使用包埋機將大鼠子宮包埋成蠟塊,子宮橫截面朝下。使用輪轉切片機將含有大鼠子宮的蠟塊切成5 μm的蠟片,展片后,將切片放于烤片機上使石蠟融化。將切片放入二甲苯中溶解石蠟。之后將切片使用從高到低濃度的乙醇進行復水。最后將蠟片置于去離子水中。獲得復水的切片后,使用蘇木素染色液進行染色,使用鹽酸乙醇溶液分化后,自來水沖洗反藍,使用尹紅染色液進行染色后,對切片進行快速脫水并封片。封片后,使用光學顯微鏡對大鼠子宮組織進行拍照。

2.7 免疫組織化學染色 獲得復水的大鼠子宮組織切片后,使用3%的H2O2孵育切片以阻斷組織中的內源性過氧化物酶。PBS緩沖液清洗切片后,使用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液在95 ℃的水浴鍋中孵育切片20 min,以修復大鼠子宮組織中的抗原。使用正常山羊血清孵育切片20 min以封閉非特異性的抗原結合位點,將TLR4和NF-κB抗體稀釋100倍后,4 ℃孵育切片過夜。之后使用HRP修飾的第二抗體在室溫孵育切片1 h。清洗后,滴加DAB顯色液,再次清洗后,使用蘇木素復染。將切片脫水、透明封片后置于光學顯微鏡下對樣本進行拍照。TLR4和NF-κB陽性表達處呈棕色,使用Image pro plus軟件,對TLR4和NF-κB陽性表達處的平均光密度進行統計。

2.8 RT-PCR檢測 冷凍保存的大鼠子宮組織,使用TRIzol法提取總的RNA。按照逆轉錄試劑盒的操作說明書將提取的大鼠子宮組織總RNA逆轉錄成cDNA。以獲得的cDNA為模板,參考SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒說明書,使用ABI7500系統檢測大鼠子宮組織中TLR4和NF-κBmRNA表達。GAPDH購買于生工生物工程 （上海）股份有限公司。目的基因使用的引物序列如下。 TLR4正向5′-GCTTGAATCCCTGCATAGAGG-3′,反向5′-TGTCTCCACAGCCACCAGATTCTC-3′；NF-κB正向5′-AACACTGCCGAGCTCAAGAT-3′,反向5′-CATCGGCTTGAGAAAAGGAG-3′； GAPDH正向 5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3′,反向 5′-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′。

2.9 統計學分析 免疫組織化學圖片數據應用Image pro plus軟件進行平均光密度的計算,計量數據以 （）表示,數據結果采用Graph Pad Prism7軟件進行方差分析和作圖。多組間的比較采用單因素方差分析,組件比較采用t檢驗,P＜0.05為有統計學意義。

3 結果

3.1 膈下逐瘀湯改善慢性盆腔炎模型大鼠血液流變學參數 與假手術組比較,模型組大鼠在不同切變率的情況下全血黏度及血漿黏度升高（P＜0.01）；與模型組比較,膈下逐瘀湯各劑量組均降低大鼠全血黏度及血漿黏度（P＜0.05,P＜0.01）。見圖1。

圖1 膈下逐瘀湯對慢性盆腔炎模型大鼠血液流變學的影響（n=10）Fig.1 Effects of Gexia Zhuyu Decoction on hemorheology of chronicpelvic inflammatory disease model rats （n=10）

3.2 膈下逐瘀湯降低慢性盆腔炎模型大鼠血清中炎癥因子的水平 與假手術組比較,模型組大鼠血清中的IL-1β、IL-6及TNF-α 水平升高 （P＜0.01）。給藥后,與模型組比較,除膈下逐瘀湯低劑量組血清IL-1β 水平未變化外（P＞0.05）,膈下逐瘀湯各劑量組IL-1β、IL-6及TNF-α 水平降低（P＜0.01）。見圖2。

3.3 膈下逐瘀湯改善慢性盆腔炎模型大鼠子宮病理學變化 HE染色結果顯示,慢性盆腔炎模型大鼠子宮炎細胞浸潤嚴重,膈下逐瘀湯給藥后減輕模型大鼠子宮內的炎癥。子宮HE染色進行組織學評分結果顯示,膈下逐瘀湯中、高劑量組改善大鼠子宮的病理組織學評分（P＜0.01）。見圖3。

3.4 膈下逐瘀湯抑制慢性盆腔炎模型大鼠子宮內TLR4及NF-κB表達 免疫組織化學染色結果顯示,與假手術組比較,大鼠子宮中TLR4及p-NFκB p65表達升高（P＜0.01）,膈下逐瘀湯給藥后降低兩者表達（P＜0.05,P＜0.01）。RT-PCR結果顯示,大鼠子宮中TLR4及NF-κBmRNA表達升高,膈下逐瘀湯治療后降低兩者mRNA表達（P＜0.05,P＜0.01）。見圖4。

4 討論

不同于PID早期時以細菌感染為主,多數慢性盆腔炎患者并無細菌感染的臨床證據,但病情仍持續進展,西醫運用抗菌治療對于急性期PID效果較好,但對慢性盆腔炎效果不明顯,尤其對細菌等病原體所致的一系列病理損害非但無效,還會因抗生素長期大量使用甚至濫用而造成嚴重的耐藥性,致使病情反復發作,遷延難愈［6-7］。西醫抗生素治療難以發揮作用,然而此病卻是中醫的優勢病種,中醫對其有獨特的治法治則,中藥對其有獨到的療效。因此,在慢性盆腔炎的臨床治療上應充分發揮中醫藥的優勢,以造福于廣大患者［8］。

源自清代王清任《醫林改錯》 中的膈下逐瘀湯為其五大活血化瘀代表方之一,是歷代醫家治療氣滯血瘀型慢性盆腔炎及痛經的經典名方,該方由當歸、川芎、赤芍、牡丹皮、延胡索、烏藥、五靈脂、桃仁、紅花、香附、積殼、甘草組成,方中當歸、川芎、赤芍、牡丹皮養血活血,清熱涼血,祛瘀止痛；延胡索、烏藥、五靈脂行氣活血,散瘀止痛；桃仁、紅花破血行瘀,活血調經；香附、枳殼疏肝理氣,調經止痛；甘草調和諸藥,緩急止痛。諸藥合用,共奏活血化瘀、行氣止痛之效［3］。對慢性盆腔炎而言,氣行血活則瘀阻自除,脹墜自消,疼痛自止,數百年的臨床實踐已充分證明,膈下逐瘀湯對慢性盆腔炎氣滯血瘀證有顯著療效［3］。

圖2 膈下逐瘀湯對慢性盆腔炎模型大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α 水平的影響（n=10）Fig.2 Effects of Gexia Zhuyu Decoction on serum levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in chronicpelvic inflammatory disease model rats （n=10）

圖3 膈下逐瘀湯對慢性盆腔炎模型大鼠子宮病理組織學的影響（n=10）Fig.3 Effects of Gexia Zhuyu Decoction on uterus histopathology of chronicpelvic inflammatory disease model rats（n=10）

圖4 膈下逐瘀湯對慢性盆腔炎模型大鼠子宮組織TLR4及NF-κB表達的影響（n=10）Fig.4 Effects of Gexia Zhuyu Decoction on protein expressions of TLR4 and NF-κB in uteruses of chronic pelvic inflammatory disease model rats （n=10）

慢性盆腔炎的主要病理變化是免疫性病理損傷,表現為盆腔局部炎性滲出、粘連和增生,這是導致病情進展的主要原因［9］。謝芳等［10］認為瘀血阻滯為慢性盆腔炎的關鍵病機,治療上應注重活血化瘀；慢性盆腔炎的病機關鍵在于血瘀,治療上亦主張采用活血化瘀法［11］。現代醫學認為,血液流變性異常是導致血液循環和微循環障礙的前提和基礎,也是中醫“血瘀證” 的重要實驗指標［12］。慢性盆腔炎患者的血液呈明顯的“濃、黏、凝” 狀態,屬于典型的血液流變學指標異常［13］。通過改變血流動力學狀態,可改善血液循環和微循環障礙,并能減輕局部缺血、缺氧,促進局部損傷組織修復,抑制組織異常增生［14］。慢性盆腔炎長期的炎性刺激易引起周圍組織粘連,局部血液循環障礙。研究顯示,膈下逐瘀湯能夠顯著改善慢性盆腔炎模型大鼠血液流變學參數,提示膈下逐瘀湯對慢性盆腔炎模型大鼠可能具有治療作用；同時,膈下逐瘀湯能夠顯著降低慢性盆腔炎模型大鼠血清中炎癥因子的水平,提示膈下逐瘀湯能夠改善慢性盆腔炎的炎性癥狀及“血瘀” 癥狀。

Toll樣受體（Toll-like receptors,TLRs）是一類重要的天然免疫模式識別受體,在天然免疫和獲得性免疫中均發揮重要作用［15］。TLR是一組跨膜受體蛋白,其配體與TLR聚合活化后,會激活NFκB炎癥信號通路。TLR介導的信號誘導編碼促炎因子相關基因的大量表達［16-17］。人類TLRs家族有12名成員已被發現,其中以TLR4為主。NF-κB作為普遍存在的轉錄因子,是多種信號轉導途徑的交匯點,不僅參與介導免疫應答、病毒復制、細胞凋亡和增殖的多種基因表達,在調節炎癥反應的基因表達中也起關鍵作用?，F已證實NF-κB可高效誘導多種細胞因子,包括IL-1β、IL-6和TNF-α 的表達,同時對參與炎癥級聯瀑布效應的多種酶的基因表達也具有重要的調控作用［18］。

雖然炎癥因子在慢性盆腔炎中的形成機制目前尚未被完全揭示和闡明,但可以確定的是炎癥反應對機體的損害主要是通過釋放炎癥因子來實現的［19］。IL-1β 可誘導IL-6的釋放,IL-6又可增強組織細胞對IL-1β 的敏感性［20］；TNF-α 作為促炎癥因子和免疫調節因子,在炎癥反應中起核心作用,是啟動炎癥的重要細胞因子,參與調節免疫應答與炎癥反應［21］。結果表明,膈下逐瘀湯可以顯著降低慢性盆腔炎模型大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α 等炎癥因子的水平,這與臨床研究的報道一致［22］。同時,研究還顯示,膈下逐瘀湯對TLR4和NF-κB在慢性盆腔炎模型大鼠子宮中的表達就有顯著的抑制作用。膈下逐瘀湯對慢性盆腔炎模型大鼠子宮中TLR4/NF-κB信號的抑制,導致IL-1β、IL-6和TNF-α 等炎癥因子水平的下降,可能是其改善慢性盆腔炎模型大鼠血液流變學,發揮治療“血瘀” 癥狀原因。

綜上所述,以歷代醫家治療氣滯血瘀型慢性盆腔炎及痛經的經典名方膈下逐瘀湯為研究對象,揭示其對慢性盆腔炎模型大鼠的抗炎作用機制,以期闡明其臨床上治療慢性盆腔炎的作用機理,為膈下逐瘀湯廣泛用于婦科炎性疾病的治療提供科學依據。