芒果苷固體脂質納米粒的制備及其體內藥動學研究

呂東霞，禹 瑞，屈戰果，范明松*

（1.鄭州澍青醫學高等專科學校，河南鄭州 450064；2.上海雷允上藥業有限公司，上海 201401）

芒果苷是芒果葉主要活性成分之一,也可從知母中提取得到［1］,具有抗糖尿病及其并發癥、調節脂代謝、抗腫瘤、心血管保護等多種藥理作用［2-4］,應用前景廣闊,具有一定研發價值,但該成分口服吸收生物利用度僅為1.2%［5］,導致其藥效發揮大打折扣。納米技術在提高藥物生物利用度方面的作用得到了醫藥工作者的公認,目前已有采用自微乳提高芒果苷生物利用度的報道［6］,但該方法需使用大量表面活性劑,存在溶血等風險［7］,故開發一種安全性較高的納米給藥系統具有重要意義。

如今,對固體脂質納米粒［8-11］的研究較多,技術也較為成熟,該方法采用生理相容性良好的載體材料將藥物包裹于其中,從而起到改變藥動學、促進吸收、提高生物利用度的目的,而且表面活性劑用量遠低于自微乳。因此,本實驗制備芒果苷固體脂質納米粒,并對其體內藥動學進行考察,以期為其他相關制劑的開發提供參考。

1 材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀,配置二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；TM-14SB型集熱式磁力攪拌器 （上海沉匯儀器有限公司）；FA1004B型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；MD200-5型氮氣吹掃儀（杭州奧威儀器有限公司）；AllegraTMX-22R型臺式高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；H-7650型透射電鏡（日本日立公司）；MixMax型渦旋混合器（合肥艾本森科研儀器有限公司）；Master-sizer型粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

芒果苷原料藥（批號110331,純度＞98%,天津市中新藥業有限公司）；芒果苷對照品（批號111558-201608,純度99.2%,中國食品藥品檢定研究院）；大豆卵磷脂（批號PC-98T,上海輔必成醫藥科技有限公司）；單硬脂酸甘油酯 （批號161025,北京鳳禮商貿有限公司）；超濾離心管（30 kDa,美國Millipore公司）；泊洛沙姆188（WPEE587E,德國巴斯夫公司）。其他試劑均為分析純。

SD大鼠,體質量（300±20）g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司,動物生產許可證號SCXK（滬）2012-0002。

2 方法與結果

2.1 芒果苷含有量測定

2.1.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流動相甲醇-0.1% 磷酸（40 ∶60）；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長258 nm。

2.1.2 線性關系考察 將10 mg芒果苷對照品溶于100 mL甲醇中,得到100 μg/mL貯備液,甲醇依次稀釋至20.0、5.0、1.0、0.1、0.05 μg/mL,作為對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X）,峰面積為縱坐標（Y）進行回歸,得方程為Y=30.115 8X+5.217 4 （r=0.999 8）,在0.05～20.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.3 方法學考察 取 “2.1.2” 項下20.0、5.0、0.05 μg/mL對照品溶液適量,在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次,測得芒果苷峰面積RSD分別為0.12%、0.24%、0.18%,表明儀器精密度良好。取1 mL納米混懸液至10 mL量瓶中,加入5 mL甲醇超聲提取后流動相定容至刻度,過0.45 μm微孔濾膜,即得供試品溶液,平行制備6份,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得芒果苷峰面積RSD為1.38%,表明該方法重復性良好。取同一份供試品溶液,于0、2、4、8、12、24 h在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得芒果苷峰面積RSD為0.72%,表明溶液在24 h內穩定性良好。取1.0 mL空白固體脂質納米粒混懸液至10 mL量瓶中,共9份,加入“2.1.2” 項下100 μg/mL對照品溶液0.5、1.0、1.5 mL各3份,再加入5 mL甲醇超聲提取后流動相定容至刻度,過0.45 μm微孔濾膜,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得芒果苷平均加樣回收率為99.31%,RSD為1.78%。

2.2 芒果苷固體脂質納米粒制備 參考文獻［8］報道的方法。取芒果苷10 mg、大豆磷脂30 mg、單硬脂酸甘油酯200 mg,置于10 mL無水乙醇中,70 ℃水浴溶解,作為油相；配制30 mL 0.5%泊洛沙姆188溶液,置于70 ℃水浴中加熱,作為水相,在800 r/min攪拌速度下將油相滴加到水相中,繼續攪拌3 h后超聲（200 W）提取10 min （每提取3 s,間隔2 s）,低溫固化,過0.45 μm微孔濾膜,0.5%SDS溶液補充體積至30 mL,即得。同法制備空白納米粒混懸液。

2.3 包封率、載藥量測定 取1 mL芒果苷固體脂質納米粒混懸液至25 mL量瓶中,加入15 mL甲醇超聲提取后流動相定容至刻度,過0.45 μm微孔濾膜,平行3份,HPLC法測得芒果苷平均總質量為332.86 μg；取納米粒混懸液1 mL,置于超濾管中,12 000 r/min離心30 min,合并濾液,取1 mL至5 mL量瓶中,平行3份,HPLC法測得游離芒果苷平均質量為64.54 μg。按照文獻［8］報道的方法測定包封率、載藥量,測得3批納米粒平均包封率為80.61%,載藥量為3.16%。

2.4 形態觀察 取芒果苷固體脂質納米粒混懸液適量,蒸餾水稀釋50倍后滴加于銅網上,自然干燥,2%磷鎢酸染色6 min后置于透射電鏡（TEM）下觀察其形態,結果見圖1。由此可知,納米粒呈類球形或橢圓形,粒子之間無粘連。

圖1 納米粒TEM圖Fig.1 TEM image for nanoparticles

2.5 粒徑、Zeta電位測定 取3批芒果苷固體脂質納米粒混懸液,蒸餾水稀釋50倍后測定其粒徑、Zeta電位,結果見圖2～3。由此可知,納米粒平均粒徑為178.63 nm,PDI為 0.083,Zeta電位為-18.2 mV。

圖2 納米粒粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of nanoparticles

圖3 納米粒Zeta電位Fig.3 Zeta potential of nanoparticles

2.6 凍干粉制備 為了增加芒果苷固體脂質納米粒穩定性,并便于大鼠灌胃給藥,本實驗將其進一步制成凍干粉。在納米粒混懸液中加入5%乳糖后混勻,分裝于2 mL西林瓶中,置于-60 ℃超低溫冰箱中預凍2 d后迅速冷凍干燥2 d （15 Pa、-20 ℃）,緩慢升溫至25 ℃并保持2 h,即得（芒果苷質量分數為0.578%）。

2.7 體外釋藥 采用透析袋法。以900 mL水（pH 1.2）為釋放介質［12］,設定溫度為37 ℃,轉速為75 r/min,取適量芒果苷固體脂質納米粒凍干粉至3 mL釋藥介質中 （以芒果苷計質量為20 mg）,以3 mL含相同原料藥的甲醇為對照,置于透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da）,于0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、36 h各取樣2 mL,并自動補加2 mL空白溶出介質,經0.22 μm微孔濾膜過濾,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,繪制體外釋藥曲線,見圖4,可知原料藥在4 h內基本釋放完全,而納米粒在前4 h屬于快速釋藥期,4 h后屬于緩慢釋藥期。再分別采用零級、一級、Higuchi、Weibull模型對納米粒體外釋藥進行擬合,結果見表1,可知其更符合Weibull模型。

圖4 芒果苷體外釋藥曲線Fig.4 In vitrodrug release curves for mangiferin

表1 模型擬合結果Tab.1 Results of model fitting

2.8 體內藥動學研究

2.8.1 分組、給藥及采血 12只大鼠隨機分為2組,每組6只,給藥前禁食12 h,自由飲水。將芒果苷及其固體脂質納米粒凍干粉分別用0.5%CMCNa溶液和純化水制成2 mg/mL混懸液,灌胃給予2組大鼠,給藥劑量均為20 mg/kg （以芒果苷計）,于0.167、0.33、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12 h眼眶采血,3 500 r/min離心3 min后取上層血漿,低溫保存。

2.8.2 血漿樣品處理 將10 mg葛根素對照品溶于50 mL甲醇中,甲醇稀釋至200 ng/mL,即得內標溶液。取“2.8.1” 項下血漿樣品100 μL,加入內標溶液20 μL、甲醇1.0 mL,渦旋混合沉降蛋白,10 000 r/min離心15 min后取上層有機相,氮氣吹除有機溶劑,加入100 μL甲醇復溶,置于帶有內襯管的液相瓶中。

2.8.3 線性關系考察 取 “2.1.2” 項下20.0 μg/mL對照品溶液,甲醇依次稀釋至2 000、1 000、500、250、100、20 ng/mL,各取100 μL,氮氣吹干后加入100 μL空白血漿,作為血漿對照品溶液,混勻,按 “2.8.2” 項下方法處理,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標（X）,芒果苷、內標峰面積比值為縱坐標 （Y）進行回歸,得方程為Y=0.240 9X+0.084 2 （r=0.992 9）,在20～2 000 ng/mL范圍內線性關系良好。

2.8.4 專屬性試驗 取血漿對照品（20 ng/mL）（按“2.8.3” 項下方法制備）+內標、給藥12 h后血漿+內標、空白血漿溶液,按“2.8.2” 項下方法處理,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,結果見圖5。由此可知,芒果苷與內標分離度良好,血漿內源性物質不干擾測定。

2.8.5 方法學考察 取 “2.8.3” 項下20、1 000、2 000 ng/mL對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6次,測得芒果苷、內標峰面積比值RSD分別為8.67、3.06%、4.14%,表明儀器精密度良好。另取上述3個質量濃度對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得加樣回收率在85.11%～92.39%之間。取含藥血漿樣品溶液適量,室溫下于0、2、6、12、18、24 h在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,測得芒果苷、內標峰面積比值RSD為8.17%,表明溶液在24 h內穩定性良好。取不含內標的對照品溶液,在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定,以S/N約為10為定量限,約為3為檢測限,測得兩者分別為5.0、2.0 ng/mL。

2.8.6 分析結果 采用3P97程序統計矩模型計算主要藥動學參數,結果見表2,血藥濃度-時間曲線見圖6。由此可知,納米粒tmax、 Cmax、AUC0～t、AUC0～∞高于原料藥（P＜0.01）,相對生物利用度提高至216.69%。

圖5 芒果苷HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of mangiferin

表2 芒果苷主要藥動學參數（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for mangiferin（， n=6）

表2 芒果苷主要藥動學參數（， n=6）Tab.2 Main pharmacokinetic parameters for mangiferin（， n=6）

注：與芒果苷比較,**P＜0.01。

圖6 芒果苷血藥濃度-時間曲線Fig.6 Plasma concentration-time curves for mangiferin

3 討論

本實驗制備芒果苷固體脂質納米粒時,采用磷脂、單硬脂酸甘油酯作為混合載體,可防止藥物被排擠出晶格,有助于增加其包封率、穩定性等［8,13］。張杰等［14］研究認為,在制備有機相時磷脂可能會與藥物形成一種親脂的藥物-磷脂復合物［15-16］,可增加藥物與載體的相容性［17］,從而提高其包封率；文獻［18］報道,聯合使用乳化劑有利于提高穩定性,降低納米制劑粒徑；本實驗所用的泊洛沙姆188可提供空間位阻,防止納米粒聚集,并且磷脂可能也會起到降低油水界面張力、提高乳化效率的作用。綜上所述,磷脂在固體脂質納米粒處方中具有多重作用。

芒果苷水溶性、脂溶性均較差［14］,從而影響了該成分溶出及透膜吸收,而且胃腸道菌群也會影響其穩定性［12,19］,導致其吸收生物利用度不理想。固體脂質納米粒可顯著增加芒果苷口服吸收,其原因可能為①納米制劑可增加藥物與胃腸道黏膜的接觸幾率,有助于其經胞間、淋巴轉運等途徑吸收；②將芒果苷包裹進納米粒后可減少與各種酶的接觸,從而起到保護作用；③處方中磷脂的存在有助于增加胃腸道滲透性［20］,增加納米粒與胃腸道的生物黏附性［21-22］,最終增加藥物被吸收進入血液循環的幾率。