永生化人肝星狀細胞株WM07 的建立

郭津生 王 滿

（復旦大學附屬中山醫(yī)院消化科 上海 200032）

肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝臟的一種非實質細胞，在肝纖維化發(fā)生中起到關鍵作用。原代分離的HSC 在體外的培養(yǎng)和傳代時間有限，傳代一定次數(shù)后就會進入衰老期而不能再繼續(xù)增殖。而反復分離原代細胞不僅費時、費力，且各批次細胞間存在差異，不能保持細胞生理指標的穩(wěn)定性。體外能無限培養(yǎng)的永生化HSC 的建立可為科學研究提供穩(wěn)定、充足的細胞材料。建立和改良人HSC 的分離培養(yǎng)方法及獲得永生化人HSC 株對于肝纖維化發(fā)生機制、診斷及治療研究具有重要意義。

已有通過脂質體介導猿猴病毒40（simian virus 40，SV40）大腫瘤抗原（large tumor antigen，TAg）基因的真核表達質粒轉染獲得永生化人HSC（LX1 及LX2）的報道［1］。既往研究中，我們采用改良酶液灌注消化及密度梯度離心兩步法從1 例中國兒童肝腫瘤手術患者的肝臟標本中分離HSC［2］，液氮凍存原代細胞。本研究通過構建慢病毒SV40 TAg 表達質粒，介導SV40 TAg 轉染該原代HSC，獲得永生化人HSC 株（命名為WM07），可穩(wěn)定傳代并用于肝纖維化研究。

材料和方法

構建SV-40 TAg 慢病毒表達載體

PCR 獲取全長SV40 TAg 序列 以含SV40 TAg cDNA 序列的SV40 tsA58 質粒［3-5］為模板，根據(jù)NCBI 的SV40 TAg 完整基因參考序列（NC_001669.1）設計特定的質粒構建引物。SV40 TAg-CF：5’-CACCATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAG-3’；SV40 TAg-CR：5’-TTATGTTTCAGGTTCAGGGGGA-3’。

高保真PCR 獲取SV40 TAg 全長cDNA PCR反應體系（50 μL）：引物混合液1.5 μL，10×Pfu DNA 聚合酶反應混合物（含dNTP）5 μL，Pfu DNA聚合酶0.5 μL，模板DNA 質粒1 μL，用滅菌去離子水補齊到50 μL。PCR 反應條件：95 ℃2 min；95 ℃15 s，58 ℃30 s，68 ℃4 min，36 個循環(huán)；68 ℃5 min；恢復至4 ℃。

PCR 產物純化 PCR 產物進行1%低熔點瓊脂糖凝膠電泳，切割回收SV40 TAg 全長cDNA PCR 條帶，pureLinkRQuickGel（美國Invitrogen 公司）提取純化PCR 產物，測定并調整為10 ng/μL濃度。

PCR 產物TOPO 克隆進入pENTRTMTOPO?載體 純化的SV40 TAg PCR 產物4 μL，鹽溶液1 μL，pENTRTMTOPO?載體（美國Invitrogen 公司）1 μL，總體積6 μL，室溫輕柔混勻，室溫放置30 min，置于冰上。

轉化和Entrez 克隆篩選 TOPO?克隆反應產物2 μL 轉化感受態(tài)大腸埃希菌（E.coli），接種于卡那霉素LB 瓊脂板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選5 個生長菌落擴增和提取質粒，以M13 正向和逆向引物進行PCR 測序（韓國Macrogen 公司），鑒定克隆的SV40 TAg cDNA 序列，獲得pENTR-SV40 TAg Entrez質粒。

LR重組反應 1.5 mL離心管中加入7 μL上述克隆表達質粒pENTR-SV40 TAg（150 ng）、1 μL 目標慢病毒載體pLenti4/V5-DEST（美國Invitrogen 公司）、8 μL TE 緩沖液、2 μL LR Clonase?Ⅱenzyme mix，混勻，25 ℃孵育1 h，加入1 μL 蛋白酶K 溶液終止反應，混勻后37 ℃孵育10 min。

將SV40 TAg cDNA 克隆到目標慢病毒載體轉化1 μL LR 反應液與50 μL Stbl3TM感受態(tài)細胞，冰上孵育30 min，42 ℃熱休克30 s，加入250 μL SOC 培養(yǎng)液，37 ℃振搖培養(yǎng)1 h，分別將20 μL 和100 μL 轉化液鋪于氨芐青霉素LB（LBA）瓊脂板。37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選5 個生長菌落擴增和提取質粒。以CMV 正向和逆向引物進行PCR 測序（韓國Macrogen 公司），鑒定克隆的SV40 TAg cDNA 序列，構建SV40 TAg 慢病毒表達載體pLenti4/V5-GW/SV40 TAg。

慢病毒包裝采用脂質體LipofectamineTM3000介導pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 慢病毒質粒（假病毒）和包裝質粒pCMV-VSV-G 及psPAX2（2∶1.5∶1）轉染工程細胞293FT，進行假病毒包裝，24、48、72 h 分別收集含包裝病毒的培養(yǎng)上清液，離心，凍存?zhèn)溆谩?/p>

HSC 分離和原代培養(yǎng)復旦大學附屬中山醫(yī)院外科手術切除人肝臟腫瘤標本，無菌操作切取病灶周圍相對正常的一小塊肝組織，按5 mL/g 用EGTA 液（含肝素20 U/mL）沿血管殘端反復灌注沖洗殘余血液，至肝組織呈灰黃色。采用改良酶液灌注消化及Nycodenz 密度梯度離心兩步法獲得原代HSC［2］。采用常規(guī)臺盼藍拒染法鑒定細胞活力。采用自發(fā)藍綠色熒光、油紅O 脂滴染色、α-平滑肌肌動蛋白（α-smα-SMA）、免疫熒光染色等方法鑒定細胞純度［2］，每3 天換液1 次，原代凍存。

永生化HSC 株WM07 的建立

SV40 TAg 轉染原代培養(yǎng)細胞并篩選轉染細胞 以含SV40 TAg 的慢病毒培養(yǎng)上清液加入細胞培養(yǎng)液中轉染原代（復蘇第2 代）培養(yǎng)細胞，48 h 后換用含50 μg/mL 博來霉素（zeocin）的10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液篩選轉染和穩(wěn)定表達SV40 TAg的原代細胞，每3天換液1 次，2～4 周后可篩選出存活細胞克隆，擴增成株。細胞株至少能穩(wěn)定傳十代。

SV40 TAg 表達的檢測 一抗采用抗SV40 TAg 抗體（1∶200，美國Santa Cruz 公司，sc-148），用Alexa Fluor 594（紅色）標記的二抗進行免疫熒光染色，檢測SV40 TAg，可作為SV40 TAg 轉染獲得永生化細胞的標志。

α-SMA 的檢測 一抗采用抗α-SMA（1∶500，英國Abcam 公司，ab5694），用Alexa Fluor 488（綠色）標記的二抗進行免疫熒光染色檢測α-SMA，作為活化HSC 的標志。

結果

SV40 TAg 全長cDNA 的鑒定高保真PCR 獲取的SV40 TAg 全長cDNA 經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR 條帶大小符合全長SV40 TAg cDNA 片段大小（2 477 bp，圖1）。

圖1 高保真PCR 獲取SV40 TAg 全長cDNA 的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 Agarose gel electrophoresis map showing a single band of high-fidelity PCR product of SV40 TAg full-length cDNA fragment

pENTR-SV40 TAg Entrez 質粒的鑒定通過M13 正向引物對pENTR-SV40 TAg Entrez 質粒進行PCR 測序，結果驗證所構建的pENTR-SV40 TAg Entrez 質粒含CACC 克隆位點（122～125）、ATG 轉錄起始位點（126～128）及SV40 TAg cDNA序列（圖2）。

慢病毒表達質粒pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 的鑒定通過CMV 正向引物對pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 慢病毒表達質粒進行PCR 測序，結果驗證所構建的質粒含ATG 轉錄起始位點（151～153）及SV40 TAg cDNA 序列（圖3）。

永生化HSC 株WM07 表達>SV40 Tag對經慢病毒介導SV40 TAg 轉染、博來霉素篩選獲得的永生化肝星狀細胞株WM07 進行SV40 TAg 的免疫熒光染色，結果顯示WM07 表達SV40 TAg，并在細胞核表達和定位（圖4）。

永生化HSC 株WM07 表達活化HSC 標志物免疫熒光染色鑒定顯示，WM07 細胞質內均表達活化HSC 的特異性標志α-SMA（圖5）。

討論

圖2 M13 正向引物對pENTR-SV40 TAg Entrez 質粒進行PCR 測序的結果Fig 2 The PCR sequencing result of pENTR-SV40 TAg Entrez plasmid by M13 forward primer

圖3 CMV 正向引物對pLenti4/V5-GW/SV40 TAg 慢病毒表達質粒進行PCR 測序結果Fig 3 PCR sequencing result of the expression plasmid of pLenti4/v5-GW/SV40 TAg lentivirus with CMV forward primer

圖4 免疫熒光染色永生化HSC 株WM07 的SV40 TAg 表達（×100）Fig 4 Immunofluorescence staining of SV40 TAg expression in theimmortalized HSC line WM07（×100）

圖5 免疫熒光染色永生化人HSC 株WM07 的α-SMA 的表達（×20）Fig 5 Immunofluorescence staining of α-SMA expression in immortalized human HSC line WM07（×20）

一些抑癌基因p53 和pRB的失活以及端粒酶的激活，是人體細胞獲得永生化的必要條件。哺乳動物細胞使用幾種方法誘導細胞永生化，包括使用SV40TAg基因、人類端粒酶逆轉錄酶基因、P53 和pRB 的小發(fā)卡或短發(fā)卡RNA（shRNA）等。SV40 TAg 是由SV40 病毒早期編碼區(qū)編碼的一種多功能磷酸蛋白，在病毒復制過程中發(fā)揮重要作用。SV40 TAg 具有活化宿主細胞核糖體基因、誘導DNA 合成、修飾蛋白質合成起始因子等作用，并且能結合、調控某些關鍵性的細胞調控蛋白，如視網膜母細胞瘤蛋白家族成員（如pRB）、腫瘤抑制因子P53 等，并可誘導感染細胞的端粒酶活性，誘導多種細胞的永生化。SV40TAg基因與宿主細胞DNA穩(wěn)定整合重組后，不但能在細胞內表達SV40 TAg，加快轉化細胞的生長速率，同時也能保留原始細胞的許多分化表型，具有相對穩(wěn)定的增殖特性和功能狀態(tài)，而在轉化細胞系中非原始基因的表達很少見。

目前已有一些方法用于介導SV40 TAg 轉染，如通過脂質體介導構建有SV40TAg基因的真核表達質粒載體，轉染目標原代細胞，并篩選獲得永生化細胞系的方法，但其轉染效率較低，篩選困難，一些較難轉染的細胞難以獲得穩(wěn)定表達和建立細胞系。慢病毒是逆轉錄病毒的一種，能夠將靶基因導入一些較難轉染的細胞內，可以有效感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞，并且將靶基因隨機整合到宿主HSC 基因組中，從而大大增加了感染效率，并且能夠在細胞系中穩(wěn)定表達若干代，可以進行穩(wěn)轉細胞株的篩選。慢病毒已廣泛用于基因功能研究、RNA干擾、小分子RNA 研究及活體動物實驗中，成為基因治療的有力工具之一。既往研究中，我們采用慢病毒載體構建和轉染方法成功進行了Toll 樣受體4及DDX5 單核苷酸基因多態(tài)性的表達和功能探討［7-8］。本研究構建一種能夠高效、快速轉染SV40 TAg 慢病毒的表達載體，該載體通過工程細胞包裝可獲得表達SV40 TAg 的慢病毒顆粒（假病毒）用于轉染原代人HSC，進而通過博來霉素抗性特點篩選獲得永生化細胞株。提供一種構建永生化細胞株的方法，并獲得一株永生化HSC 株WM07，可穩(wěn)定傳代，并可用于肝纖維化研究，具有重要的應用價值。

致謝美國紐約西奈山肝病中心Scott L.Friedman 教授給予指導和幫助。