女性生殖道外泌體在精子成熟與胚胎發育中的研究進展

桂紹濤，趙 暉，熊 磊，羅 韜，雷 銀，吳汶釗

外泌體是由機體活細胞通過內吞-融合-外排等生物學機制產生的納米級囊泡，通過后期向內出芽形成多囊泡體，再通過多囊泡體與質膜融合釋放至細胞外[1]，具有雙層脂質膜結構，直徑30～150 nm[2-3]，甚至可達200 nm[4]。外泌體首次于1983年由Johnstone在羊的成熟紅細胞中發現，其在透射電子顯微鏡下常表現為杯狀或雙凹碟狀，密度在蔗糖濃度梯度及碘二甲醇濃度梯度中分別為1.10～1.21 g/ml和1.10～1.12 g/ml[5-6]。外泌體表面分子通過囊泡黏附至受體細胞表面的脂質和配體，使整個囊泡內化到受體細胞，外泌體膜與受體細胞的質膜融合，從而促進與其他細胞的相互作用[7]。存在于體液中的外泌體在細胞信息交換中起重要作用，其與受體細胞之間存在3種作用機制[8]：①外泌體與受體細胞融合，并將其內容物傳送至細胞質溶膠中[9]；②外泌體的跨膜蛋白可直接與靶細胞的信號受體相互作用[10]；③外泌體被內化到受體細胞并出現下列情況，即部分被吞噬的外泌體可以合并形成內體并經歷轉胞吞作用將外泌體再次釋放至鄰近細胞，而部分被吞噬的外泌體形成的內體可成熟為溶酶體并降解[11-12]。本文以女性生殖道外泌體在精子成熟與胚胎發育中的研究進展進行綜述。

1 女性生殖道外泌體的分離與鑒定

選擇分離和純化的具體方法應考慮樣品來源、體積、純度、完整性、后續分析所需的外泌體及可用的儀器和處理時間，目前常見的外泌體分離方法有離心法(如超速離心法、差速離心法、密度梯度離心法、蔗糖墊離心法)、超濾法(如凝膠滲透色譜法、尺寸排斥色譜法等[13])、沉淀法和免疫磁珠法等[14]。目前從培養的生殖細胞和女性生殖道體液中分離的外泌體常使用超速離心法進行分離。有學者使用蔗糖墊離心法、超濾法和超速離心法分離外泌體，發現超速離心法可以得到足夠的蛋白組合轉錄組學材料以用于進一步分析，明顯優于蔗糖墊離心法及超濾法[15]。外泌體分離純化后進行鑒定的常見方法為透射電子顯微鏡檢測、納米粒子示蹤分析、免疫印跡法、流式細胞術及高分辨率成像等[13]。在透射電子顯微鏡下可直接觀察外泌體的形態和直徑，是目前鑒定外泌體的金標準之一，但其無法準確測量外泌體濃度，不適合快速大量檢測外泌體。免疫印跡法可鑒定多數外泌體常見蛋白質，如CD63、CD9、CD81、熱休克蛋白等跨膜細胞蛋白[16-17]。

2 女性生殖道外泌體的類型

女性生殖道外泌體根據形成部位和生物機制，主要分為輸卵管小體、子宮小體和陰道小體。

2.1輸卵管小體 輸卵管小體于2013年由Al-Dossary等[18]在小鼠輸卵管液中首次發現。有文獻報道，輸卵管小體是輸卵管液的主要成分，并且是與配子-胚胎母體相互作用的潛在介質[19]。輸卵管小體包含一系列生物活性分子，如蛋白質、mRNA、lncRNA、脂質及基因組DNA，可以通過活性分子反映細胞生理及病理狀態[20]。目前已在不同物種的輸卵管液中分離出輸卵管小體(小鼠[18]、牛[21]、人類[22]、狗[23]等)，并且對狗、鼠、牛3種輸卵管小體的miRNA進行鑒定，發現2種共有的miRNA，即miR-30b和miR-375[24]，其中miR-375與氨基酸代謝、核苷酸代謝、糖代謝有關，并參與早期胚胎發育[23,25]。

2.2子宮小體 子宮小體于2008年由Griffiths等[26]首次在發情的小鼠子宮腔液中發現，已有學者證明子宮小體是由子宮內膜上皮細胞分泌[27]，其內部所包含的蛋白質是以周期性方式接受女性雌激素與孕激素的調節[28]。Greening等[29]研究表明，來自人子宮內膜上皮細胞的高度純化的子宮小體蛋白組受類固醇激素調節，當雌激素主要作用時，子宮小體的蛋白質組富含與細胞膜骨架重組和信號級聯反應相關的蛋白質，并參與子宮內膜修復。有研究表明，RNA、miRNA在子宮細胞外囊泡中選擇性包裝[30]。現已發現214個miRNA是子宮小體及其起源細胞所共有的，其中13個特異性miRNA選擇性地包裝在子宮小體中，并且參與了胚胎植入的重要途徑，如細胞重塑、增殖及血管生成。有研究發現，子宮小體被人類HTR-8滋養層細胞轉移內化，增強了黏附功能，部分通過激酶信號傳導[29]，并檢測到hsa-miR-30d，發現使用miR-30d處理小鼠胚胎可顯著增加胚胎黏附性[31]。

2.3陰道小體 陰道小體于2018年首次于成熟發情小鼠陰道分泌液中發現[32]，其攜帶特征性生物標志物(CD9、CD81和HSC70)及精子調節蛋白(PMCAs和酪氨酸磷酸化蛋白)，其中精子調節蛋白對精子成熟與獲能具有重要作用。有研究發現，女性陰道分泌液中的陰道小體對人類免疫缺陷病毒-1早期的生命周期具有抑制作用，可以使女性免受人類免疫缺陷病毒-1感染[33]。有學者發現，壓力性尿失禁女性患者的陰道壁成纖維細胞所分泌的陰道小體具有抑制新生血管生成的作用，推測其可能在壓力性尿失禁的病理過程中發揮重要作用[34]。

3 女性生殖道外泌體與精子成熟之間的相關作用

精子混合著精液在離開男性生殖道進入女性生殖道時，其與陰道、子宮內膜和輸卵管環境相互作用，最終實現成功受精，但期間精子必須經歷獲能，即精子頭膜經歷一系列生化修飾，使精子到達卵母細胞的透明帶時能夠進行頂體反應，導致酶釋放，允許精子穿透透明帶與細胞質膜融合，而女性生殖道外泌體對精子功能連續編程起著重要作用[35]。

在精子進入女性生殖道后，大部分精子滯留于陰道，形成陰道栓。陰道黏膜分泌的外泌體可與精子相互作用，其中陰道小體可使精子細胞膜的PMCA4a與蛋白精子黏附分子-1顯著增加，共同使精子進一步成熟、獲能，增加受精能力[32]。PMCA4a是精子膜上主要的Ca2+外排泵，調節精子的Ca2+動態平衡。有研究表明，PMCA4a基因缺失可導致精子的進行性和過度活躍的運動性喪失，致雄性不育[36]。蛋白精子黏附分子-1是一種透明質酸酶，促使精子穿透卵丘基質和卵泡周圍空間。子宮小體及輸卵管小體在精子成熟與獲能方面也起著重要作用，可以改變精子表面膜成分和新陳代謝，且均攜帶大量PMCA4a。有研究發現，小鼠輸卵管小體PMCA4a形式比子宮小體的PMCA4a更有優勢，并且與其他周期相比，在發情前期、發情期PMCA4a高度表達，輸卵管小體通過整合素αvβ3和α5β介導與精子膜融合并將PMCA4a傳遞給精子，同時PMCA4a可以防止精子過早獲能和支持精子受精潛力[32]。

4 女性生殖道外泌體與胚胎之間的相互作用

子宮小體在孕期滋養層細胞的產生中起著重要作用。Greening等[29]研究發現，人體子宮內膜來源的ECC1細胞系分泌的外泌體可被HTR-8滋養層細胞所攝取并增強黏附功能，并且與子宮小體共同培養1.5 h后，HTR-8滋養層細胞出現最大的黏附改變并維持4 h，更重要的是，與僅用雌激素處理的細胞(增殖期)相比，當親本細胞用雌激素與孕激素處理以模擬接受性子宮內膜時，黏附率明顯高于單獨雌激素處理的細胞，且黏附刺激與子宮小體黏附分子含量的蛋白質組數據是一致的，其中纖維連接蛋白在HTR-8滋養層細胞中隨著外泌體攝取而增加。此外，黏著斑激酶(FAK)途徑各因子水平顯著增加，表現為總FAK和磷酸化FAK蛋白的高水平表達，表明該途徑可能參與了子宮小體攝取后HTR-8滋養層細胞黏附功能的增加[30]，并且FAK亦是胚胎囊泡、內細胞團和滋養外胚層細胞之間的細胞外囊泡通訊通路之一[28]。Ng等[30]認為，在精子植入前期，細胞外微環境內的部分子宮小體可以通過FAK信號傳導來調節滋養層細胞黏附性。有研究報道，通過體外培養胚胎與牛輸卵管小體時發現，胚泡可以主動攝取輸卵管小體，并且在攝取之后明顯改善胚泡質量，延長胚泡存活期，提高體外存活率和細胞、胚胎數量[21]。Lopera-Vasquez等[37]發現輸卵管小體通過下調IFN-τ和PLAC8(與胚胎植入相關的基因)來改變胚胎的基因表達，從而改善胚胎發育和質量，并且該表達模式與體內胚胎類似。國外學者發現，小鼠輸卵管小體可以改變體外培養胚胎細胞凋亡和細胞增殖相關基因(BAX、BCL-2、OCT-4)來抑制細胞凋亡和促進細胞分化，從而改善胚胎存活率[38]。

外泌體中含有多種金屬蛋白酶，如基質金屬蛋白酶-14、金屬蛋白酶-10。國外學者研究表明，基質金屬蛋白酶-14、金屬蛋白酶-10可以調節子宮小體不同因子的活性和生物利用度，進而影響胚胎和子宮內膜之間的相互作用[30,39]。有研究顯示，基質金屬蛋白酶-14、金屬蛋白酶-10對促進胚胎植入和早孕有著重要的作用[28]。有研究報道，輸卵管小體可以通過提高精子獲能和受精能力，從而改善胚胎發育及低溫抗性[18,22]，提高胚胎移植率和出生率[38]。有學者通過牛輸卵管小體質譜分析鑒定了336個蛋白質簇，發現多種蛋白對受精及早期胚胎發育起著至關重要的作用[24]，并且在排卵后期有助于精子從精子庫中釋放，并使精子過度活化、運輸，以滿足卵母細胞受精和早期胚胎發育[24,40]。

5 展望

女性生殖道外泌體作為精子與女性生殖道及胚胎與母體之間的直接和間接的交流方式，通過介導一系列外泌體的分子機制來研發女性生殖道新的調節劑，并通過對外泌體內部miRNA的進一步探索，有助于實現新的納米治療與納米診斷，使得外泌體在女性生殖能力方面具有一定的診斷和治療潛力。