提高基層非洲豬瘟熒光PCR檢測(cè)準(zhǔn)確性的措施

童洪生 丘富安 李寶蘭

（1.建寧縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 福建建寧 354500；2.福州中科基因有限公司 福州 350003；3.三明市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 福建三明 365000）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種豬的高度接觸性烈性傳染病，其發(fā)病率、病死率都很高；非洲豬瘟病毒屬于DNA病毒，病毒粒子較大，基因型多，基因組變異頻繁，病毒在環(huán)境中比較穩(wěn)定。OIE將該病列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病[1]。2018年8月，遼寧省沈陽(yáng)市確診我國(guó)首例非洲豬瘟，至今全國(guó)所有省份都已出現(xiàn)非洲豬瘟疫情[2]，對(duì)我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)重創(chuàng)，為做好非洲豬瘟防控工作，國(guó)家和各省市加大了對(duì)基層動(dòng)物疫病防控基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)投入的力度，大力推廣病原學(xué)PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)，委托各市、縣（市、區(qū)）自行開(kāi)展非洲豬瘟等檢測(cè)工作；同時(shí)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求自2019年7月1日起，各屠宰場(chǎng)須自行開(kāi)展非洲豬瘟檢測(cè)工作。由于市級(jí)、縣級(jí)和屠宰場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室各方面條件（包括實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)環(huán)境條件、儀器設(shè)備條件、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員等）參差不齊，因此，規(guī)范開(kāi)展非洲豬瘟熒光PCR檢測(cè)，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度，是當(dāng)前工作中面臨的重要任務(wù)。

1 完善實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施

1.1 實(shí)驗(yàn)室功能分區(qū) 熒光PCR試驗(yàn)應(yīng)分區(qū)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室必須分隔為試劑準(zhǔn)備、樣品制備、核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物分析等三個(gè)獨(dú)立工作區(qū)域。為防止核酸氣溶膠對(duì)試驗(yàn)過(guò)程造成污染，避免試驗(yàn)之間的相互干擾，各工作區(qū)域之間應(yīng)具備單向的氣流、物流與人流，形成單向流程的保護(hù)屏障。

1.2 配備必要的儀器設(shè)備 熒光PCR實(shí)驗(yàn)室必須配備熒光PCR儀、低溫離心機(jī)、核酸提取儀、生物安全柜、冰箱、移液器等主要儀器設(shè)備，并嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行維護(hù)，保證其在規(guī)定參數(shù)內(nèi)正常運(yùn)行。

2 強(qiáng)化人員培訓(xùn)，實(shí)行專(zhuān)人專(zhuān)崗

2.1 人員資質(zhì) 熒光PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室必須配備具有畜牧獸醫(yī)專(zhuān)業(yè)大專(zhuān)以上學(xué)歷的專(zhuān)職檢測(cè)人員1~2名，經(jīng)相關(guān)的檢測(cè)技術(shù)、生物安全培訓(xùn)，獲得上崗資格后方可開(kāi)展熒光PCR檢測(cè)工作。

2.2 培訓(xùn)與考核 要制定并執(zhí)行定期考核和培訓(xùn)制度，必要時(shí)派人參加更高級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室培訓(xùn)和跟班學(xué)習(xí)，以提升檢測(cè)人員的檢測(cè)技能。省市要定期對(duì)開(kāi)展非洲豬瘟熒光PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行盲樣比對(duì)考核。

3 做好樣品和試劑的管控

3.1 樣品的管控 在采樣過(guò)程中要避免交叉污染；樣本送達(dá)后應(yīng)做好登記、編號(hào)，并存放于4℃冰箱或陰涼處，及時(shí)進(jìn)行分離和制備，盡快進(jìn)行檢測(cè)；48 h內(nèi)無(wú)法開(kāi)展檢測(cè)或需要留樣的應(yīng)儲(chǔ)存于-20℃冰柜冷凍保存；送上級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)的樣品，應(yīng)妥善包裝后盡快冷藏寄送。

3.2 試劑的管控 采購(gòu)的非洲豬瘟熒光PCR診斷試劑盒必須符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的規(guī)定和要求，有相應(yīng)的批準(zhǔn)文號(hào)；要按試劑盒的要求妥善保存試劑，避免使用偽劣、過(guò)期或失效試劑。PCR反應(yīng)液對(duì)溫度敏感，每次使用時(shí)應(yīng)置于冰上，用完后盡快冷凍保存，凍融次數(shù)不宜過(guò)多。

4 按規(guī)程開(kāi)展檢測(cè)

4.1 檢測(cè)方法 熒光PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)優(yōu)先按國(guó)家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法開(kāi)展檢測(cè)，非標(biāo)準(zhǔn)方法則需經(jīng)過(guò)確認(rèn)后方可使用，所有采用的檢測(cè)方法要受控管理。不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的非洲豬瘟病毒熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒，其檢測(cè)方法略有不同，應(yīng)嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)的要求操作。

4.2 混樣 非洲豬瘟檢測(cè)工作任務(wù)非常繁重，成本較高。為適應(yīng)基層大批量檢測(cè)工作和降低檢測(cè)費(fèi)用的需要，對(duì)檢測(cè)樣品可以根據(jù)不同的對(duì)象和要求進(jìn)行混樣檢測(cè)。可以采用5合1混樣進(jìn)行檢測(cè)，一般不能超過(guò)10合1的比例。若混樣比例過(guò)高，容易出現(xiàn)因被檢樣品核酸濃度小于最低檢測(cè)限值，發(fā)生假陰性的結(jié)果。

4.3 樣品的留存 用于豬瘟檢測(cè)的樣品，應(yīng)根據(jù)不同的要求做好留樣。屠宰場(chǎng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按規(guī)定對(duì)樣品進(jìn)行編號(hào)、留樣，冷凍保存1個(gè)月。檢測(cè)結(jié)果為疑似陽(yáng)性的樣品，如果需要留樣的，應(yīng)單獨(dú)保存，并在樣品復(fù)核和送檢完成后對(duì)樣品及時(shí)進(jìn)行無(wú)害化處理。

4.4 陽(yáng)性樣品的復(fù)核 若樣品在采集和制備過(guò)程中被污染，可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)疑似陽(yáng)性的，有條件的實(shí)驗(yàn)室可以選擇不同的試劑盒進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果一致的才能確定為陽(yáng)性。如果是用混樣進(jìn)行檢測(cè)，則需要用未經(jīng)混樣前的樣品逐份進(jìn)行檢測(cè)，以確定陽(yáng)性個(gè)體和陽(yáng)性數(shù)量。必要時(shí)將疑似陽(yáng)性樣品送級(jí)別更高的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行進(jìn)一步診斷。

5 做好實(shí)驗(yàn)室生物安全

1）非洲豬瘟病毒在自然條件下可以長(zhǎng)時(shí)間保持感染性，在感染豬分泌物和環(huán)境污染物中長(zhǎng)期存活，在糞便內(nèi)可存活160 d，在土壤中存活190 d[3]。為避免病毒通過(guò)污染的用具、廢棄的物品進(jìn)行傳播，熒光PCR實(shí)驗(yàn)室要做好人員和物品進(jìn)出的管控，廢棄物品必須經(jīng)過(guò)高壓滅菌處理，不可隨意丟棄。

2）熒光PCR試驗(yàn)完畢后，必須對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境徹底消毒。生物安全柜和潔凈工作臺(tái)進(jìn)行紫外照射消毒，時(shí)間不低于30 min，以破壞殘留的核酸；工作臺(tái)面等用10%次氯酸或75%酒精等消毒液消毒；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的樣本液和擴(kuò)增產(chǎn)物是氣溶膠的主要污染源，故實(shí)驗(yàn)室要經(jīng)常換氣和消毒；所有試驗(yàn)區(qū)域，包括懸掛白大褂位置、放置高速離心機(jī)位置、放置PCR儀等區(qū)域都要用可移動(dòng)紫外線(xiàn)燈照射30 min。