高效液相色譜測定季銨鹽復合消毒液中的苯扎溴銨和鄰苯二甲醛

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(河南醫學高等專科學校藥學系化學教研室,鄭州 451191)

鄰苯二甲醛(OPA)是雙醛基芳香化合物,具有腐蝕性小和毒性低等優點,是醫院消化內鏡首選消毒劑[1]。文獻[2]研究了4種市售OPA消毒劑的細菌芽孢殺滅效果,其中3種OPA消毒劑在作用300 min的殺滅對數仍不理想。文獻[3]將苯扎溴銨作為增效成分,與OPA復配后制備了季銨鹽復合消毒液,改變了單一OPA作用時殺滅細菌芽孢速度慢的缺點。文獻[4]認為復合消毒液中的苯扎溴銨能夠附著在菌體表面,改變細胞壁和細胞膜的通透性和滲透壓,使OPA更易進入細胞內部,從而增強了細菌芽孢殺滅效果。苯扎溴銨和OPA的配比會影響這種復合消毒液的殺菌效果,因此,需要建立一種可以同時測定這兩種物質含量的方法,以控制生產過程中兩者的含量和配比。但是,由于復合消毒液的基質較為復雜,目前還未見可供參考的國家標準和文獻方法。

現行的《消毒技術規范》[5]采用滴定法測定苯扎溴銨的含量,但沒有規定OPA的測定方法;文獻[6]中采用滴定法,分光光度法和液相色譜法測定了OPA含量。其中,滴定法和分光光度法僅適用于簡單基體消毒劑中單一組分含量的測定。基于先分離后定量的高效液相色譜法(HPLC)是測定復合消毒劑中多組分含量的可靠方法[7]。目前國外文獻多采用有機試劑將OPA衍生后,再用HPLC對其進行測定[8],該方法靈敏度高,適用于醫療產品表面殘留的痕量OPA測定,但存在衍生步驟復雜,精密度和回收率較差等缺點。市售消毒產品中OPA含量一般在0.50%(質量分數)以上,季銨鹽殺菌液中苯扎溴銨的質量濃度通常為500 mg·L-1,含量均較高,屬于微量分析,無需進行衍生,直接采用HPLC即可滿足測試要求。因此,本工作采用HPLC測定了季銨鹽復合消毒液中的苯扎溴銨和OPA含量,以期為生產過程中苯扎溴銨和OPA含量的監控提供技術參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Alliance 269型高效液相色譜儀;CT 15RE型高速離心機。

苯扎溴銨標準溶液:10.9 g·L-1。

苯扎溴銨標準儲備溶液:2.0 g·L-1,量取苯扎溴銨標準溶液1.83mL,用水定容至10.0mL。

OPA標準儲備溶液:2.0 g·L-1,稱量0.2 g OPA標準品,用水溶解并定容至100.0mL,超聲輔助混合均勻。

混合標準溶液系列:取適量苯扎溴銨和OPA標準儲備溶液,用水稀釋,配制成苯扎溴銨和OPA質量濃度分別為10.0,20.0,50.0,100.0,200.0,400.0,800.0 mg·L-1的混合標準溶液系列。

OPA標準品純度不小于98%;甲醇為色譜純,其他試劑為優級純或分析純;試驗用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流動相為體積比為1∶1的0.02 mol·L-1的乙酸-乙酸銨緩沖溶液(pH 4.5)和甲醇,等度洗脫;色譜柱溫度30 ℃;檢測波長263 nm;進樣體積10μL;流量1.0mL·min-1。

1.3 試驗方法

取1.0mL樣品于10mL容量瓶中,用流動相定容至刻度,渦旋混合5 min后過0.45μm濾膜,濾液按照儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 檢測波長

為了得到苯扎溴銨和OPA的最佳檢測波長,試驗選擇在190～400 nm內,對混合標準溶液進行紫外-可見光譜掃描,結果見圖1。

圖1 苯扎溴銨和OPA的紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of UV-Vis of benzalkonium bromide and OPA

由圖1可知:OPA的特征吸收波長在263 nm附近;苯扎溴銨的特征吸收波長在220,263,300 nm處。其中263 nm為苯扎溴銨和OPA的共同特征波長,且此處的背景吸收和噪音干擾較小、檢測靈敏度較高且抗干擾能力較強,故選擇在263nm處測定苯扎溴銨和OPA。

2.1.2 色譜柱

在色譜柱選擇方面,美國藥典[9]和中國藥典[10]分別推薦采用氰基柱和C18色譜柱分離苯扎溴銨,而氰基柱和C18色譜柱都可用來分離OPA。因此,試驗考察了分別采用氰基柱和C18色譜柱作為色譜柱時對苯扎溴銨和OPA色譜分離效果的影響。結果發現:以氰基柱為色譜柱分離時,苯扎溴銨保留時間的重現性不好,測定結果易出現假陽性;以C18色譜柱分離時,苯扎溴銨和OPA色譜分離效果均較好,故試驗選擇采用C18色譜柱分離季銨鹽復合消毒液中的兩種有效成分。

2.1.3 流動相組成

苯扎溴銨是極性陽離子表面活性劑,易與C18色譜柱固定相中殘存的硅醇基形成氫鍵,造成色譜峰拖尾現象。文獻[11-14]在流動相中加入庚烷磺酸鈉離子對試劑,通過磺酸根陰離子與季銨鹽陽離子締合成中性離子對改善了苯扎溴銨在C18色譜柱上的保留性能,但是離子對試劑會在色譜柱的固定相上產生不可逆吸附,損傷色譜柱。經過反復試驗,試驗選擇體積比為1∶1的乙酸-乙酸銨緩沖溶液(pH 4.5)和甲醇為流動相,其中的乙酸根陰離子可與季銨鹽陽離子形成中性化合物,增加苯扎溴銨在色譜柱上的保留;而乙酸-乙酸銨緩沖溶液可保持流動相的酸度穩定和一定離子強度,從而達到改善目標物峰型,減少色譜峰拖尾的目的。

優化后的色譜條件見1.2節,按此條件得到的樣品和混合標準溶液的色譜圖見圖2。

圖2 混合標準溶液和樣品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed standard solution and sample

由圖2可知:在優化的色譜條件下,混合標準溶液在10 min內即可達到基線分離,OPA和苯扎溴銨的色譜峰峰形對稱且無拖尾現象,保留時間分別為4.3,7.1 min。樣品中的苯扎溴銨和OPA也得到了基線分離,且其保留時間與混合標準溶液的基本一致(相對偏差小于1.0%)。

2.2 標準曲線和檢出限

按照儀器工作條件對混合標準溶液系列進行測定,以苯扎溴銨和OPA的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果發現,苯扎溴銨和OPA標準曲線的線性范圍均為10.0～800.0 mg·L-1,線性回歸方程分別為y＝8.730×103x＋6.820×102和y＝2.750×104x＋1.310×103,線性相關系數分別為0.999 0,0.999 5。

按照儀器工作條件分別對混合標準溶液和加標樣品空白進行測定,以3倍信噪比(S/N)計算苯扎溴銨和OPA儀器檢出限和方法檢出限,所得結果分別為3.0,2.0 mg·L-1和5.0,3.5 mg·L-1。

2.3 樣品分析

按照試驗方法對3種季銨鹽復合消毒液樣品進行測定,每個樣品平行測定7次,計算測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表1。其中,3種季銨鹽復合消毒液樣品中OPA的標示值為0.35%～0.55%,苯扎溴銨的標示值為不小于330 mg·L-1。

取10mL樣品于100mL錐形瓶中,分別加入苯扎溴銨標準儲備溶液0.82,1.64,4.92mL和OPA標準儲備溶液1.0,2.0,5.0mL,混合均勻后,轉移至100mL的容量瓶中,用流動相稀釋至刻度,按照儀器工作條件測定,每個濃度水平平行測定3次,計算低、中、高等3個濃度水平的回收率,均平均值,所得結果見表1。

表1 樣品分析結果(n＝7)Tab.1 Analytical results of samples(n＝7)

由表1可以看出:樣品中的苯扎溴銨和OPA的測定值與標示值相符;苯扎溴銨和OPA測定值的RSD均小于1.0%;苯扎溴銨的回收率為93.7%～95.2%,OPA的回收率為94.5%～98.5%。該方法選擇HPLC同時測定季銨鹽復合消毒液中的苯扎溴銨和OPA含量。該方法前處理簡單、精密度和準確度均較高,適用于季銨鹽復合消毒液產品中苯扎溴銨和OPA含量的同時測定。