上海地區(qū)生鮮乳中致病性大腸桿菌的排查

徐 鋒 沈莉萍 張維誼 齊新永 陸仲斐 朱培元 王 建*

（1上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海市長寧區(qū) 201103；2上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海市青浦區(qū) 201708）

奶牛乳房炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中的一大難題，直接影響著牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量，偶爾也會引起乳品安全問題[1]，而在近幾年國內(nèi)報道的奶牛乳房炎的病原菌中，大腸桿菌占比已超過金黃色葡萄球菌、穩(wěn)居首位[2-4]，且在生鮮乳中，大腸桿菌也有較高的檢出率[5-7]，有的甚至高達50.83%[8]。

上海地區(qū)奶牛乳房炎的主要病原菌一直是以金黃色葡萄球菌為主的革蘭氏陽性球菌[9-10]，但近幾年的相關(guān)報道較少。同時，由于《GB 19301-2010 食品安全國家標準生乳》的頒布，取消了對生鮮乳中致病菌的檢測，更導(dǎo)致相關(guān)數(shù)據(jù)缺乏。因此，上海地區(qū)奶牛乳房炎主要致病菌的變化，是否會導(dǎo)致生鮮乳中致病菌的變化，是否會對上海地區(qū)乳品安全造成威脅，還需進行深入探討和研究。在此背景下，筆者擬對上海地區(qū)幾家乳品加工廠生產(chǎn)的生鮮乳中的大腸桿菌進行摸底調(diào)查，以期了解其污染程度、致病性、耐藥性及血清型分布情況，從而評估生鮮乳中的大腸桿菌對食品安全是否存在風險，并擬通過對環(huán)境樣本中大腸桿菌進行檢測，查找可能的污染源，以便采取相應(yīng)的措施，避免或減少生鮮乳中大腸桿菌的污染?，F(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 本

生鮮乳樣本：分別于2019年9月和12月分2次進行樣本采集，共80份樣本，采集自上海的3個乳品加工廠，樣本來源于40個奶牛養(yǎng)殖場。

環(huán)境樣本：2019年9月—12月分4次采樣，共163份樣本，包括乳頭奶、乳房表面拭子、操作人員手部拭子、奶罐奶、奶襯表面拭子、墊料、飼料、土壤、糞便等，均采自同一個標準化奶牛場。

1.1.2 培養(yǎng)基

EC肉湯、伊紅美藍瓊脂（EMB）、麥康凱瓊脂（MAC）、Columbia血瓊脂基礎(chǔ)等培養(yǎng)基均購自北京陸橋。

1.1.3 試 劑

產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）細菌的核酸測定試劑盒購自上海之江；大腸桿菌腸道產(chǎn)毒性（ETEC）、腸道侵襲性(EIEC)、腸道致病性（EPEC）分型血清購自蘭州生物制品研究所；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列詳見表1。

1.1.4 主要儀器

儀器主要是微生物質(zhì)譜鑒定儀（VITEK MS，法國生物梅里埃）、熒光PCR儀（7500，ABI）、普通PCR儀（Biometra TAdvanced，德國耶拿）。

1.2 排查方法

1.2.1 樣本處理

生鮮乳、乳頭奶等液體樣本和拭子樣本直接取樣；墊料、飼料、土壤和糞便樣本稱取5 g加入到含50 mL滅菌生理鹽水的無菌過濾袋中，充分混勻，然后取濾液作為檢測樣本。

1.2.2 生鮮乳中菌落總數(shù)的測定

吸取25 mL樣品至盛有225 mL滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分混勻，制成10-1樣品勻液；取1 mL 10-1樣品勻液至9 mL滅菌生理鹽水無菌試管中進行10倍稀釋，依次10倍稀釋至10-2、10-3、10-4、10-5；吸取1 mL各稀釋度的樣品勻液，置于無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿重復(fù)，同時做空白對照；將冷卻至46 ℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注至平皿中，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻；待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，于36 ℃±1 ℃下培養(yǎng)48 h±2 h。

表1 PCR引物序列

1.2.3 大腸桿菌的分離鑒定

鑒定：取1 mL檢樣加入到9 mL EC肉湯培養(yǎng)基中，振蕩混勻后于36 ℃培養(yǎng)24 h；用接種環(huán)蘸取增菌液分別接種EMB平板和MAC平板，于36℃下培養(yǎng)24 h；然后從EMB平板和MAC平板分別挑取若干可疑菌落，接種Columbia羊血平板進行純化，于36 ℃下培養(yǎng)18～24 h；再用1 μL接種環(huán)挑取單菌落均勻涂在靶板位點上，然后滴加1μL MS-CHCA基質(zhì)液覆蓋在上面，待完全干燥后，放入VITEK MS質(zhì)譜儀進行鑒定，約10 min后獲得鑒定結(jié)果。

血清分型：使用大腸桿菌腸道產(chǎn)毒性（ETEC）、腸道侵襲性(EIEC)、腸道致病性（EPEC）血清進行玻片凝集試驗。

1.2.4 大腸桿菌毒力基因的檢測

對從生鮮乳中分離的大腸桿菌，選擇常見的8種毒力基因（K88、K99、987P、F18、F41、STa、STb、LT）進行PCR檢測。

反應(yīng)體系（25 μL）：Taq 酶 preMix 12.5 μL，引物（濃度10 μM）各1 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O補足至25 μL。

核酸擴增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、退火溫度60 s、72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃-∞。

電泳采取1.5%濃度瓊脂糖凝膠。

2 結(jié)果與分析

2.1 生鮮乳中的菌落總數(shù)

由圖1可知，在80份生鮮乳樣本中，菌落總數(shù)最大值為2 900 CFU/mL，平均值為58.08 CFU/mL。

2.2 大腸桿菌的分離鑒定

通過對從80份生鮮乳樣本和163份環(huán)境樣本中分離的細菌進行VITEK MS鑒定發(fā)現(xiàn)，生鮮乳中大腸桿菌的分離率為63.5%，而環(huán)境樣本中的大腸桿菌主要分離自墊料、土壤、糞便，分離率分別為75%、75%、50%。同時，鑒定還發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌和其它腸桿菌科細菌也有較高的占比。見圖2。

2.3 致病性大腸桿菌的血清分型

由表2可知，從生鮮乳中分離的50株大腸桿菌中，有15株致病性大腸桿菌，其中，腸道產(chǎn)毒性大腸桿菌（ETEC）菌株6株、占比為12%，腸道致病性大腸桿菌（EPEC）菌株9株、占比為18%；腸道侵襲性大腸桿菌(EIEC)菌株未檢出。

2.4 大腸桿菌毒力基因的檢測

由圖3可知，從生鮮乳中分離的50株大腸桿菌中，檢出5株攜帶K99基因（攜帶率為10%）、12株攜帶LT型基因（攜帶率為24%）、2株攜帶ST基因（包括STa和STb，攜帶率合計為4%）。

表2 致病性大腸桿菌血清分型

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，上海地區(qū)生鮮乳中的菌落總數(shù)遠低于國家標準要求，符合國家規(guī)定；生鮮乳中大腸桿菌的檢出率較高，且有致病性大腸桿菌及其腸毒素的存在，故不宜直接食用；致病性大腸桿菌在巴氏滅菌乳中可能有殘留，在冷藏條件下可增殖，對乳品安全存在風險，建議對生鮮乳中致病性大腸桿菌進行監(jiān)控，以杜絕隱患。

3.2 討 論

生鮮乳普遍采用巴氏消毒法進行滅菌，通常采用65 ℃維持30 min或75～90 ℃維持15 s，但最近有報道表明，大腸桿菌O157:H7在80 ℃維持10 min，仍不能被完全殺滅[11]，說明巴氏消毒奶細菌總數(shù)的達標，不等于殺滅了所有的致病性大腸桿菌，且其在8 ℃左右仍可繁殖[12]，一旦冷鏈出現(xiàn)問題或超過保質(zhì)期，就會影響奶質(zhì)，甚至?xí)斐墒澄镏卸尽Ｍ瑫r，在近幾年的奶牛乳房炎病原菌檢測中，大腸桿菌的占比居高不下。上海市及其周邊地區(qū)奶牛場的乳房炎奶牛乳中大腸桿菌的檢出率通常在20%～40%[3，13-14]。而本研究結(jié)果表明，上海地區(qū)生鮮乳中的菌落總數(shù)均未超標，但大腸桿菌的分離率高達63.5%，這可能與上海地區(qū)潮濕的氣候有關(guān)，且大腸桿菌耐熱并能在低溫增殖的特點也是一個重要因素。

大腸桿菌是人和動物腸道內(nèi)的常在菌，其分布極為廣泛，生活中幾乎無處不在，通常認為是一種條件致病菌。本研究結(jié)果表明，環(huán)境樣本中墊料、土壤、糞便中的大腸桿菌分離率較高，證實了奶牛場環(huán)境中確實存在大量的大腸桿菌，而奶牛場是開放式環(huán)境，空氣流動、人員走動、野生動物走動、運輸工具流動等都有可能造成污染，故要及時清除污染物，且采用科學(xué)的消毒方法就顯得尤為重要[15]。同時，在乳頭奶、乳房表面及操作人員手部等環(huán)境樣本中也分離到大腸桿菌，預(yù)示在整個擠奶過程中可能存在消毒不到位的問題，需要對消毒劑的選擇、稀釋濃度、作用時間和人員的防范意識等進行優(yōu)化。此外，在奶牛場的奶罐奶中未檢出有大腸桿菌，這與生鮮乳中的菌落總數(shù)結(jié)果（平均58.08 CFU/mL）相符，說明上海地區(qū)生鮮乳的細菌污染程度較低，上海地區(qū)的奶源質(zhì)量是有保障的。

ETEC是引起人和動物腹瀉的重要病原菌，其特征性的致病因子為腸毒素和黏附素。本研究中ETEC的檢出率為12%，而腸毒素基因的檢測率合計為28%（熱敏腸毒素LT基因為24%，耐熱腸毒素ST基因為4%），表明有一半的菌株未鑒定出血清型，而這些菌株均有可能具有致病性。同時，鑒于LT腸毒素在60 ℃維持15 min才可被滅活，ST腸毒素在100 ℃維持15 min還能保持活性[16]，而本研究的腸毒素檢測結(jié)果以LT基因為主，ST基因只有個別菌株攜帶，表明上海地區(qū)的生鮮乳經(jīng)巴氏消毒后，大部分大腸桿菌腸毒素可被滅活而失去致病性，殘存的少量ST腸毒素被大量牛奶稀釋后對人類健康已不構(gòu)成威脅，但仍存在隱患，需要在源頭進行根除。此外，ETEC和EPEC是引起犢牛腹瀉和敗血癥的主要病原菌，而規(guī)模化奶牛場以K99菌毛致病菌株的致病率最高[17]，本研究僅檢出K99基因，該結(jié)果與姜宣鵬等報道的奶牛場黏附素基因的檢測結(jié)果一致[18]，說明本研究分離的部分大腸桿菌菌株來源于奶牛，且具有較強的致病性。

EPEC大多會引起幼畜和嬰幼兒腹瀉[19]，嚴重的甚至可以致死[20]。近幾年，在我國有關(guān)EPEC的感染發(fā)病已鮮有報道。本研究中EPEC的檢出率為18%，涉及O26、O44、O55、O114、O125五個血清群，這些血清型在國內(nèi)的牛源大腸桿菌中也均有檢出[21-22]，但由于EPEC同EHEC在遺傳和表型上很近，尤其是O26血清群和O55血清群的一些血清型歸屬于EHEC，其有很強的致病性，且本研究未檢測出志賀毒素及相關(guān)毒力基因，故目前無法進行區(qū)分，需要進一步開展更加細致深入的研究。