合作豬DRB基因外顯子3遺傳變異分析

李越洲，張 勇

（甘肅農業大學 動物醫學院，甘肅 蘭州 730070）

高等脊椎動物均存在主要組織相容性復合體（Major Histocompatibility Complex, MHC）[1,2]的表達，其表達高低對動物的免疫排斥反應有一定的影響，且與動物抗病性關聯[3]。MHC作為動物疾病抗性和易感性基因，其相關的研究對輔助選擇動物抗病育種具有重要意義[4,5]。豬MHC又稱為SLA（Swine Lymphocyte Antigen），位于7號染色體上，分為三個主要類群[6]。SLA基因的多態性與動物免疫反應高度關聯，其中第二類群（SLAⅡ）基因的表達參與調控了外源性病原和相關疫苗制劑的免疫應答過程[7]。目前SLAⅡ中4個重要功能基因DRA、DRB、DQA和DQB研究最為廣泛。研究表明這些基因在控制機體的免疫應答與免疫調節中起著重要作用[8]，且參與調控豬的抗病性能[7,8]。

合作豬又叫蕨麻豬、山豬或草豬，是甘肅省甘南藏族自治州特有的高原小型原始地方品種，其抗逆性（抗病、抗寒和抗高原等）的研究可為地方豬抗病選育提供重要參考。利用單核苷酸多態性（Single nucleotide polymorphism，SNP）分析個體基因組可更好地解釋個體的表型差異[6]。目前有關豬SLA 基因功能研究主要在SLAⅡ 的DRA和DQA基因及DRB 外顯子2。合作豬SLA 基因功能的研究報道甚少。解析合作豬SLA基因與個體表型差異和遺傳相關性，可為引進地方優質品種和高經濟價值國外豬品種提供依據。研究其多態性位點及遺傳關聯性對豬品種保護以及分子遺傳選育具有重要價值。

該研究選用PCR-SSCP和DNA克隆及測序等分子生物學實驗技術對合作豬DRB基因的第3外顯子序列多態性分析，為深入揭示合作豬的免疫、抗病力的分子理論提供支持，同時為地方優質豬品種遺傳育種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以合作豬為實驗動物。采集甘肅省甘南藏族自治州合作市的合作豬血樣286份，每份5 ml抗凝血，-20℃凍存備用。采用苯酚-氯仿抽提法[9,10]提取其基因組DNA，TE溶解，-20℃凍存。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 參考GenBank數據庫合作豬SLADRB基因全序列（登錄號：FJ905840.1）設計一對引物（見表1），引物由北京華大生物公司合成，其擴增片段為332 bp。

表1 合作豬DRB基因的外顯子3引物相關信息

1.2.2 PCR擴增 以DNA為模板，進行PCR擴增，獲得DRB外顯子3序列。具體PCR擴增反應過程如下[11]：總體積為 20 μl，其中包含 200 ng/μl 的上下游引物各 0.4 μl，10 mmol/L dNTP 0.5 μl，DNA模板約為50 ng，5 U 的DNA 聚合酶0.2 μl。反應條件如下：預變性 94 ℃ 3 min，變性 94 ℃1 min，退火 57 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 50 s，共計35個循環，最后延伸 72 ℃ 10 min，反應結束后于4 ℃ 保存。PCR產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳，對目的片段進行檢測和分析。

1.2.3 擴增產物SSCP檢測 取上述PCR產物3 μl加入7 μl的考馬斯上樣緩沖液中，進行98 ℃變性10 min；冰浴 10 min。經14 %非變性聚丙烯酰胺凝膠（Arc：Bis= 37.5∶1），250 V，4 ℃電泳 35 h，通過銀染法顯色并照相記錄和辨別分型。經SSCP分析和辨型后，利用瓊脂糖凝膠進行目的條帶的純化，利用回收試劑盒回收不同基因型個體的PCR產物[12]。

1.2.4 克隆及測序 回收后的目的DNA片段進行pGEM-T Easy載體連接，構建重組質粒，并轉化大腸桿菌（Scherichiacoli）DH5α菌株，挑選10個優質菌落培養，菌液經PCR擴增和14%的非變性聚丙烯酰胺凝膠（Arc：Bis= 37.5∶1）電泳（250 V，4℃，35 h），對各個樣本和基因型鑒定后送北京華大公司進行測序和鑒定。

1.2.5 數據分析 通過Dnasp 4.0軟件分析核苷酸變異位點、氨基酸變異位點以及單倍型[13]；采用Clustal X 軟件對核苷酸及氨基酸同源序列進行比對分析[14]；利用MEGA 3.0軟件構建系統發育樹[15]；SPSS 17.0軟件進行Hardy-Weinberg平衡狀態統計學分析。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增合作豬DRB基因第三外顯子

合作豬DRB基因第三外顯子的PCR擴增產物經1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳（見圖 1），獲得了一條清晰且特異性較好條帶，其大小約為330 bp，與預期目的片段大小一致。說明該結果可進行下一步的SSCP分析。

圖1 合作豬DRB基因第3外顯子PCR擴增產物

2.2 合作豬DRB基因第三外顯子PCR-SSCP檢測

合作豬DRB基因第三外顯子的PCR擴增產物經SSCP檢測進行辨型（見圖2），將不同基因型的個體的PCR產物進行純化回收后克隆其序列。以菌液和基因組DNA為模板，進行PCR擴增后。其產物進行SSCP比較分析，取上述結果一致的產物進行測序。圖2所示為最終確定的測序菌落PCR產物及其SSCP 檢測結果。菌液PCR產物經SSCP檢測的條帶均發現重復，并與基因組DNA的PCR產物經SSCP檢測結果中尋得對應的條帶。根據上述辨型結果，對菌液進行測序，以確定不同的等位基因。

圖2 合作豬DRB基因第3外顯子菌液PCR-SSCP檢測

2.3 合作豬DRB基因第三外顯子克隆和測序

合作豬DRB基因外顯子3菌液PCR產物經北京六合華大基因公司測序，結果如圖3所示。所得測序結果未出現套峰及雜峰現象，可用于核苷酸序列分析。通過對286頭合作豬DRB基因第三外顯子進行PCR-SSCP、克隆、測序和序列比較分析，結果發現DRB基因第三外顯子存在15個特異性的單倍型序列。

圖3 DRB基因第3外顯子菌液測序結果

2.4 合作豬DRB基因第三外顯子多態位點和等位基因差異分析

286頭合作豬共檢測到15個等位基因，分別定義為S1～S15，DRB第三外顯子的15個單倍型序列進行比對分析，發現與其同源性為98.94%；隨后核苷酸序列比對發現了21個變異位點，占分析位點的7.45%；其中16個轉換位點，約為變異位點的76.19%，其中G/A的轉換位點7個，T/C的轉換位點9個。顛換位點5個，約為變異位點的23.81%，其中G/C的顛換3個，A/T的顛換2個。結果表明DRB第3外顯子的變異中核苷酸轉換變異占比較大。本試驗獲得的15個單倍型序列與GenBank中豬DRB序列（登錄號：FJ905840.1）比對發現其差異較大（見圖 4）。

圖4 合作豬DRB基因第三外顯子等位基因核苷酸比對結果

2.5 等位基因系統發育分析

利用ClustalX軟件對合作豬DRB基因外顯子3的序列構建進化樹（見圖 5）。結果顯示合作豬DRB基因第3外顯子序列系統樹未呈現大的分支現象，全為細小分支。結合核苷酸序列比對結果，推斷DRB基因可能是由同一等位基因突變分化而來的。

圖5 合作豬 DRB基因第三外顯子核苷酸序列的NJ進化樹

3 討論

合作豬是我國甘肅省南部甘南地區的主要經濟豬品種，是世界上高海拔放牧的豬種之一，具有較強的抗逆性、其肉質鮮嫩[16]、飼料利用率高等多個特點。目前合作豬相關基因的研究主要涉及其生長和發育、抗病性狀、繁殖性狀等經濟性狀相關的候選基因。本研究利用PCR-SSCP技術對286頭合作豬的DRB基因第3外顯子進行多態性分析，發現其多態性極豐富，共發現15個等位基因。經核苷酸序列比對分析，結果顯示合作豬DRB基因第3外顯子15個等位基因與豬同源性達到98.94%。結果發現21個突變位點且單個等位基因變異位點數量較少，說明DRB基因第3外顯子序列相對比較穩定，推斷合作豬群體生活環境變化不大。等位基因系統發育分析顯示，系統發育樹未出現較大分支，全為細小分支，恰好與核苷酸序列比對中單個等位基因突變位點較少相一致。推斷合作豬DRB基因最初可能是由同一個等位基因發生細微突變，發育而來的。本研究結果為解析合作豬SLA基因與個體表型差異和遺傳相關性提供參考，也為地方優質品種保護和選育提供依據。