富集環境對豬決策行為的影響

張振玲（編譯）

（徐州生物工程職業技術學院動物工程學院，江蘇 徐州 221006）

愛荷華博弈任務（Iowa Gambling Task, IGT）是研究決策，尤其是風險決策行為的一種慣用方法。IGT通過模擬真實情境以測試受試者在規避和承擔風險時的決策行為，最初是為了測試前額葉皮質損傷患者在頭腦不甚清醒的情況下，做選擇的能力而開發設計的，隨后稍做修改應用于臨床研究，精神類疾病患者在IGT測試中均表現欠佳。為研究和評估豬的決策行為，開發了豬的博弈任務（Pig Gambling Task, PGT）。PGT 測試中供試豬只有兩種選擇（有利或不利），供試豬只寧愿選擇回報較小但卻更頻繁的獎勵（有利選擇）而不選擇回報高但頻次卻較低的獎勵（即不利選擇）。PGT測試中的懲罰主要是使獎勵物無法得到（逆向懲罰）。最優策略就是做出受到較少懲罰和獲得較小回報的有利選擇，而不是得到更多懲罰和更大回報。

動物的生存環境影響其學習和完成博弈任務的能力。

1 研究目的

研究不同圈舍條件（富集和貧瘠環境）對豬只決策行為的影響。飼養在貧瘠環境中的仔豬經歷長期壓力，假設貧瘠環境中飼養的仔豬，比飼養在富集環境中的同窩仔豬學習最優策略的速度更慢，以及做出不利選擇的行為更頻繁。兩組供試仔豬在14周后均再次進行測試，以評估PGT中決策行為能力的長期保留情況。技能獲取和保留階段結束后，立即采集唾液和毛發樣本，以測定其中的皮質醇了解豬只急性和慢性應激情況。為了評估富集環境對豬生長性能的影響，所有供試豬只均在3周齡和26周齡時稱重。

2 材料和方法

2.1 動物倫理方面

本研究得到荷蘭烏得勒支大學（Utrecht University）倫理委員會審查和批準并在歐盟第86/609/EEC號指令下進行。盡量減少供試動物的使用量并避免使供試動物產生任何痛苦。

2.2 試驗項目和儀器

2.2.1 供試動物

從10窩仔豬（杜洛克×大白或杜洛克×丹系長白）中選出20頭公仔豬。仔豬出生在烏得勒支大學德托勒克農場，每窩仔豬數10～15頭。母豬胎次情況沒有記錄。所有仔豬3～7日齡斷尾，不剪牙，不去勢。1周齡后開始所有仔豬都可接觸盛有“Romelko“乳豬料的料槽，在斷奶前和后各1周使用“Romelko prevent 3”教槽料。

3周齡時選擇供試豬。每窩選擇最接近平均窩體重的1對公仔豬，并將其中1頭隨機分配到貧瘠環境，另1頭隨機分配到富集環境中。4周齡時，供試仔豬斷奶的同時剃凈仔豬的肋兩側，以便后期取毛發進行皮質醇含量的測量，然后再送到試驗中心（靠近仔豬出生的圈舍旁）。在試驗中心，供試仔豬在各自的試驗環境組里（貧瘠環境和富集環境）組成數個重復群（每群10頭）其試驗時序表（見圖1）。供試仔豬均按體重級別并按照飼料供應商的建議進行飼喂。

2.2.2 豬舍

兩個大小相等相鄰豬舍（5 m×4 m）其中1個設置為貧瘠環境，另1個提供富集環境，兩個豬舍都有上蓋覆蓋的仔豬窩巢（1.3 m ×3.6 m)。環境富集豬舍及仔豬窩巢區的混凝土地板上覆蓋1層厚稻草以刺激豬只拱刨行為和探索行為，此外還有置于地板上的球、足球和木棒及串聯在鏈子上的塑料咀嚼棒和球等環境富集材料。貧瘠環境也包含1個鏈條，1個球和2個咀嚼棒，以滿足最低的動物福利要求。貧瘠環境豬舍及仔豬窩區混凝土地板裸露。兩豬舍豬只都可自由飲水，在非訓練和試驗日，每天早晨提供豬只全天飼料。訓練和試驗期間每天早上只提供25%的飼料，其余75%晚上才能吃到。

圖1 是斷奶、取唾液和毛發樣本時供試豬大約周齡或日齡以及體重情況，以及在PGT試驗中豬適應、獲得和保留技能各測試時間。從左至右依次為：第20天（原文中是第26天有誤，從圖上看應是第20天）選擇和稱重仔重；第24天唾液取樣；第33天斷奶：趕往試驗圈欄；第38天仔豬適應試驗人員和獎勵；第40天適應試驗區，剃毛（斷奶1周后）；第42天供試豬群體適應性通過，并能打開中央食槽得到獎勵；第49天單個供試豬進入試驗區（打開食槽和目標盒）；第52天球置于碗上方10 cm處；第53天球置于碗上方；第55天訓練，將獎勵（巧克力）置于中央食槽；第63天，1 d強化試驗20次；第69天強化試驗，將2枚巧克力置于有利選擇的目標盒里，4枚置于不利選擇的目標盒里；第70天開始獲得技能階段，共進行120次試驗，然后采集唾液和毛發樣品；第161天進行4次強化試驗；第162天進入技能保持階段，共進行12次試驗，然后采集唾液和毛發樣品；第177天，稱重。

2.2.3 試驗裝置

試驗在位于豬舍附近的PGT試驗裝置中進行（圖2）。每個斯塔特盒（start box）大小為1.2 m2，與測試場地（3.6 m×2.4 m）經由1個前廳（1.2 m2）相連。測試臺上有兩個目標盒，每個目標盒具有由1個大的硬塑料球（直徑為24 cm）覆蓋的食物碗。球可以從碗里升起，但不能被移走。由試驗者遠程操控。前廳和測試場地之間的門總是大開，以增加斯塔特盒的大小。目標盒是試驗的關鍵點所在。用荷蘭一家公司產的M&M's?巧克力作為給豬只獎勵，控制系統（可控制獎勵能否獲得以及獲得多少）位于測試場地的另一面（背面），距兩個目標盒的距離相等（圖2. B，C，D）。獎勵物置于兩個漏斗中，連接到裝置后部的”Y”形輸送管上，該管道連接測試場中的一個食槽（圖2A）。試驗人員控制從漏斗向食物碗中釋放獎勵物（圖2C）。該食物管道由透明且有孔洞的蓋子（Perspex?）覆蓋著，蓋子打開與否由試驗人員（通過升高或降低）控制（圖2D）。巧克力落下的聲音，透明的碗蓋等一些線索可使供試只豬通過聲音、嗅覺或味覺等感受到食物碗中有巧克力獎勵。

2.3 試驗程序

2.3.1 習慣試驗裝置設備及訓練（供試群體）

供試豬只到研究中心后要不受干擾地待4 d。然后，在接下來的2 d里，供試豬只適應并習慣試驗設備以及獎勵物—巧克力。兩個試驗處理組的供試豬只分別單獨離開各自圈舍進入通往試驗區的走廊。到達后1周，每個試驗處理組分別允許每天3次（連續2 d）在等待室和PGT裝置中進行探索。封閉進入目標盒的通道（即關閉目標盒前面的門）。在接下來的2 d里，兩個試驗處理組（各10頭）每天各進行2次訓練，訓練供試仔豬探索PGT裝置。供試仔豬在斯塔特箱中停留約30 s，才能允許進入測試室。然后，在接下來的2 d時間里，兩個試驗處理組的仔豬每天各進行2次訓練（供試仔豬由最初每組各10頭減至各5頭然后再減至各2頭）。最后，在接下來的2 d時間里，兩個試驗處理每組只有1頭供試豬只進入試驗區。試驗開始的時候，獎勵物巧克力散置于角落和中央食槽。隨著試驗的進行，巧克力只置于中央食槽中。當豬把所有的巧克力獎品都吃光，即可進入下一步訓練。

2.3.2 試驗裝置訓練（單頭供試豬）

一個大且硬的紅色塑料球懸掛在裝有巧克力獎勵的目標盒的食物碗上方10 cm處。在1.5 d的時間里，進行3次訓練，使供試仔豬推動或舉起塑料球以得到巧克力。接下來的試驗，目標盒中的球被降下以完全覆蓋食物碗。這些供試仔豬在中央食槽發現并得到了巧克力獎勵。在3個連續的試驗中，在1.5 d的時間里，試驗仔豬只有在中央食槽中才能獲得獎勵。經過大約5 d的訓練，所有的供試驗仔豬都學會了推動或舉起塑料球，以便在中央食槽中得到獎勵。

有些試驗仔豬總是接近同一個目標盒（某側偏好）。為了打破供試豬只的這一習慣，在供試豬只進入測試區之前，首先打開偏好側對面的目標盒且關閉偏好側的目標盒（強化試驗）。接下來的5 d里，每頭供試仔豬接受2組（每組10次）強化試驗。任何能使塑料球移動的舉動都可以得到中央食槽里的巧克力獎勵。然后，連續6 d兩個試驗處理的仔豬每天接受2組（每組10次）試驗，即每頭供試仔豬每天接受20次試驗。左側或右側的目標盒按偽隨機（pseudorandom）的次序打開，對每個試驗處理每頭供試仔豬各打開5次。試驗豬只移開有利選擇目標盒可能得到了2個巧克力獎勵，移開不利選擇目標盒則有可能得到4個巧克力的獎勵。每頭豬的優勢側是左還是右是豬隨機決定的。

2.3.3 獲得和保持階段

接下來兩個目標盒均打開，供試豬只可以選擇推動或舉起其中任一個目標盒中的塑料球。對供試仔豬進行為期6 d的試驗，每天1個試驗處理組。對每個當天進行試驗的處理組每天進行2次試驗（每次連續測試10次）。每只供試仔豬連續測試10次，每次試驗持續時間通常在35～70 s之間。每頭試驗仔豬完成第10次試驗，使其離開PGT試驗設備。對同一試驗處理（富集或貧瘠環境）的供試仔豬一個接一個的測試。然后，對另一試驗處理組的供試仔豬采用同樣的測試程序。每個試驗處理設置一個重復。在斯塔特箱呆30 s后，控制門打開，供試豬只進入測試區。仔豬對目標盒中的任何正確反應（推動或舉起塑料球）后都會有獎勵被傳遞到中央的食物碗中，碗上蓋有透明有孔塑料蓋，可以使豬只看并且聞到巧克力的味道。巧克力獎勵的數量以及能否得到預先已設定好。選擇有利目標盒的獎勵雖然每次只有2個巧克力，但是得到的可能性是80%。選擇不利目標盒的獎勵每次有4個巧克力，但能得到的可能性只有30%。從長遠來看，在每組20項試驗中，供試豬只做出有利選擇實際最多可得到32個巧克力獎勵，而不利的選擇實際最多只可獲得24個。當供試仔豬完成選擇后，給其25 s時間享用巧克力獎勵。如果供試仔豬在60 s內沒有做出選擇，兩個目標盒都將關閉，供試豬將在測試區再停留60 s（延遲時間60 s再進行試驗）。然后，再讓供試豬只進入斯塔特箱，下一次試驗開始。循環進行試驗，重復10次。當獲得技能階段（6個試驗組的2輪連續10次的試驗，即總共120次試驗）結束時，訓練暫停。

經過14周的保留時間段再次進行測試。所有供試驗豬先進行了4次強化試驗，2次打開左邊目標盒，2次打開右邊目標盒，每打開1次目標盒供試豬只得到1個巧克力獎勵。本試驗證實所有供試豬只都記得已學會的技能。與獲得技能階段不同的是，在保留階段供試豬只體格已經長得較大，很難再在斯塔特箱中呆下。因此連續6 d，每天只進行了1輪測試，連續進行20次（每天6次，各20次，即總共120次）。

2.4 唾液和毛發中的皮質醇濃度

2.4.1 唾液和毛發取樣與稱重

斷奶前2 d第1次取唾液標本。遺憾的是唾液樣本量不足以可靠地測定皮質醇濃度。斷奶后1周，將供試仔豬兩肋側的毛發剃掉以利于取樣和測定毛發皮質醇濃度。遺憾的是最后毛發量亦不足以測定皮質醇的濃度。

獲得技能和保留技能階段最后1次（第120次）試驗結束后立即采集唾液和毛發樣本。每頭供試仔豬用兩根棉簽（德國漢堡海因茨棉簽150×4 mm WA 2PL）吸取唾液，進行進一步分析。14:00～18:00采集唾液標本。每頭供試豬只都嚼棉簽直到棉簽完全潤濕為止。供試仔豬靠近試驗人員并不由自主地嚼棉簽（即意味著取樣過程中豬沒有受到任何干擾或限制）。

然后，每頭供試豬只由1名試驗人員抓住，然后由另1名試驗人員剃取豬脅側的毛發，每頭收集0.5～1 g。毛發樣品在室溫下存放在鋁箔中。

在保留階段結束后，在最后1次試驗結束之后，按照上述方法再次收集唾液樣本。毛發采樣時，供試豬只已經和試驗人員非常熟了，無需額外的人員輔助，試驗人員順利地剃取了供試豬只毛發樣品。

第3周和第26周測量所有供試豬只體重。

2.4.2 唾液皮質醇

將棉簽置于特殊的帶有內心的離心管中并在10 ℃快速離心10 min（3 500 g）。除去裝有棉簽拭子的包裝后，收集到的唾液儲存在同一管中（-20 ℃）待測皮質醇濃度（采用放射免疫法）。所有樣品均于同1天檢測。單位nmol L-1。

2.4.3 毛發皮質醇

將50～250 mg豬毛發樣品用5 ml異丙醇在50 ml試管中輕輕混合清洗（滾軸轉速20）3 min，清洗2次，盡量減少糞便和尿液中的皮質醇對毛發的污染。37 ℃干燥4 d后用高精密分析天平稱取約50 mg毛發樣品置于2 ml離心管中。毛發樣品在30 Hz的頻率下研磨15 min然后離心（17 000 g，40 ℃）5 min。若樣品還不呈粉末狀，則重復進行研磨和離心。

將25～45 mg的細粉末置于一離心管（Eppendorf）中。每個離心管中加入1 ml甲醇，在避免光照的室溫下保存24 h，同時管子在搖床上緩慢來回搖動。然后4 ℃下17 000 g離心5 min。隨后取0.6 ml上清液置于一新管中4 ℃保存。提取物在干燥器中干燥2.5～3 h，中溫，然后保存在-20 ℃條件下留待進一步分析。將干燥后的提取物溶于100 μ1磷酸鹽緩沖液（測定稀釋劑）中，用高靈敏度的唾液皮質醇ELISA試劑盒在300次/min的搖瓶中搖動24 h。樣品在-20 ℃條件下再次儲存。再根據制造商說明進一步使用ELISA試劑盒進行分析。所有的分析1式2份。光密度數值經校正最后計算出實際使用的毛發量。皮質醇濃度單位為ng.mg-1。

2.5 統計分析

所有分析均采用統計軟件SAS 9.4版進行，具體過程略。

3 結果

3.1 有利選擇

供試豬只技能獲得階段6個連續試驗中做出有利選擇數量均有所增加（圖3A）且兩個試驗處理組（貧瘠和富集環境下）的結果相似。貧瘠環境條件下飼養的供試豬只比富集環境條件下的豬只做出更多顯著的有利選擇。

圖3A技能獲得和保留階段每組20組，試驗中貧瘠和富集環境中飼養供試豬只做出有利選擇的數目。黑色為貧瘠環境，無色為富集環境。

圖3B技能獲得和保留期間有利選擇高于不利選擇的試驗次數圖。黑色為貧瘠環境，無色為富集環境。

圖3C技能獲得和保留階段的延遲做出有利和不利選擇的試驗次數。黑色為不利選擇，無色為有利選擇。

供試豬只保留階段做出有利選擇的數量略有增加趨勢。環境條件不影響保留階段供試豬只做出有利選擇的數量。

供試豬只做出有利選擇的數量在獲得階段結束（獲得階段的第6組試驗）到保留階段的開始（保留階段的第1組試驗）之間顯著下降，但這一下降不受飼養環境的影響。

3.2 有利選擇超過不利選擇的試驗數量

供試豬只做出有利選擇數量略有超過不利選擇的趨勢且不受環境條件影響（圖3B）。

3.3 供試豬只做出有利和不利選擇的遲滯反應時間

貧瘠環境條件下飼養的供試豬只做出不利選擇比做出有利選擇時的遲滯時間長（圖3C），但沒有得到統計意義上的支持。

3.4 唾液和毛發皮質醇

Shapiro Wilk檢驗表明所有皮質醇濃度值均呈正態分布。貧瘠和富集環境中斷奶供試豬只唾液和毛發樣本中皮質醇濃度樣本分別在獲得階段后（約9周齡）和保留階段（約23周齡）后采集。給出了兩組分別10頭豬的均值和標準差。

3.4.1 唾液皮質醇濃度

技能獲得和保留階段后飼養環境以及取樣時間點對唾液皮質醇的測試結果均無影響（圖4A）。

3.4.2 毛發皮質醇濃度

飼養環境對毛發皮質醇濃度水平影響不同。貧瘠環境條件中飼養的豬只毛發皮質醇濃度水平比富集環境中飼養的高（圖4B），這一差異在技能獲得階段后比保留階段后更為明顯。

3.5 體重

供試豬只體重和生長速度基本不受飼養環境的影響（圖4C）。

4 討論

4.1 技能獲得和保留階段

貧瘠環境條件生長的供試豬只在技能獲得階段與富集環境下飼養的豬相比，會做出更多地有利選擇。貧瘠環境條件下生長的豬只學習速度更快，但統計數據并不完全支持。技能獲得和保留兩個階段供試豬只做出有利選擇數目，均超過不利選擇的數目，且不受環境條件的影響。貧瘠環境條件下生長的供試豬只，在技能獲得階段可能更善于權衡每種選擇的可能性，最大限度地增加其收益，這意味著貧瘠環境條件下生長的供試豬只記憶能力更好。貧瘠環境條件下生長的豬可能比富集環境下生長的豬，可以更快地揣摩到潛在的可能性。這也間接印證了富集環境中飼養的老鼠學習速度較慢。試驗結束時，兩個供試組的豬只生長性能水平相當。

4.2 遲滯反應時間

供試豬只做出不利選擇時的遲滯反應（猶豫）時間，似乎比做出有利選擇時的時間要長，但這一點沒有得到統計的支持。更長的猶豫時間通常與錯誤的選擇更相關。

4.3 情感狀態

此次試驗結果確實證實了貧瘠環境條件中生長的豬的行為與喜歡冒險選擇的老鼠的行為相似這一事先假設。但是，貧瘠環境條件可能引致豬只的負面情感狀態，并沒有促使供試豬只做出更多的不利選擇。

富集環境條件下生長的豬只，在有試驗人員接近時比貧瘠環境條件下的生長的豬只表現出更多的焦慮行為（表現出更頻繁、更快地向后退卻的行為）。但是卻似乎對新的刺激反應不是那么焦慮，這可能是因為豬圈內環境富集物多的原因。貧瘠環境中生長的豬只比富集環境中的豬群體間更加合作。高度焦慮導致大鼠的行為表現下降（做出有利的選擇較少），富集環境條件下生長的豬只在獲得技能階段的表現，與貧瘠環境條件下飼養的豬只相比亦不佳，因為其做出的有利的選擇較少。

此次研究中，兩種環境下的生長的供試豬只在獲得技能階段雖都表現出較強的，有利選擇的傾向，但貧瘠環境條件下生長的供試豬只做出的有利選擇較富集環境中生長的豬只更多。這表明貧瘠環境中生長的豬只較富集環境中的生長的豬只更不喜歡冒風險。

4.4 訓練可作為環境富集的一種新方式

貧瘠環境中生長的供試豬只，并非沒有任何環境富集。與富集環境中生長的供試豬只一樣，在適應和習慣測試設備和程序的過程中，以及在PGT設備的訓練和測試中，每天都會經歷一段時間的照料（環境富集的一種方式）。訓練為供試豬只提供了學習機會，而學習亦被認為是環境富集的一種方式。與其他形式的環境富集方式相似，訓練也可以減輕動物的應激和壓力，并能增加物種的特異性行為、增強動物的生物功能（例如大腦發育、體能和健康），提高其靈活性，增加行為多樣性以及提高探索能力。環境富集也能減少動物的一些不正常的行為（如動物的刻板行為）因此，訓練作為一種環境富集方式亦可增加豬只的環境富集度，并能影響貧瘠或富集環境中飼養的豬只的行為。

4.5 巧克力中黃酮類風味物質的可能作用

巧克力可激勵供試驗豬只學習，但巧克力中的類黃酮成分（特別是黃烷醇）也有提高供試豬只的認知效應。1個巧克力重0.9 g，含有70%的可可，50個含有可可31.9 g。單次給大鼠可可100 mg（每100 g大鼠體重）可顯著減輕大鼠的恐懼感，長期服用（兩周）可提高其大腦中與情緒相關的神經遞質血清素（5-羥色胺）的濃度水平及其周轉效率。短期攝入可可有抗焦慮作用，而長期攝入則影響腦中單胺類神經遞質的代謝。在正常衰老、癡呆和中風的動物模型中，長期服用黃烷醇顯示出其對衰老或患病動物的行為和神經認知下降有保護作用，包括減少與疾病和衰老相關的認知下降程度。巧克力（比此次研究中高得多的劑量）具有認知增強效應，但不能完全否認少量的可可亦具有增強認知的可能性。再加上潛在的認知富集效應，這些綜合效應可能部分掩蓋了圈舍條件對供試豬只PGT表現的潛在影響。

4.6 圈舍大小

此次研究中的豬只比常規飼養的豬只活動空間更大。此次研究中的每頭供試豬只都有2 m2空間（研究結束豬26周齡時，貧瘠環境中生長的供試豬只體重為104.60±5.86 kg；富集環境中生長的豬只體重為106.90±5.33 kg（圖4C））。此次研究中較大的豬舍空間可能會影響到試驗結果，因為豬只享有更大的空間也相當于給予環境富集。更大的空間提高了供試豬只探索圈舍內環境的行為，并減少了攻擊性行為的發生。

4.7 唾液和毛發皮質醇濃度

貧瘠的環境對豬只的福利有負面影響。皮質醇水平通常用于評估動物的慢性應激壓力及動物福利。此次試驗中貧瘠環境中生長的供試豬只毛發皮質醇濃度水平（在富集或貧瘠環境后的前5周）高于富集環境中生長的豬，但在之后的14周則無較大差異。毛發皮質醇濃度水平增加反映了供試豬只長期的應激壓力。此次研究表明貧瘠環境中生長的豬只在試驗環境中的前幾周經歷了更多的應激壓力。唾液和血液（及糞便）中皮質醇的短期內濃度水平發生變化，不能準確反映其應激情況；毛發皮質醇濃度水平并不代表短時間內（數分鐘或數小時計）的應激反應，但是可以更好地反映圈舍環境對HPA軸的長期影響情況。

圈舍環境條件不影響供試豬只的唾液皮質醇濃度水平。但富集環境中飼養的豬只唾液皮質醇的濃度水平與貧瘠環境中的豬相比，有上升的趨勢。此次試驗研究中唾液皮質醇的濃度只在一個時間點上進行了測量，所以這是目前研究設計的一個缺憾，若測試前和/或測試后包括更多測量時間點的話，環境對唾液皮質醇濃度水平的影響就會顯示出來。

5 結論

圈舍條件影響供試豬只完成PGT測試的表現。貧瘠環境條件下生長的供試豬只在技能獲得階段比富集環境下生長的豬只表現更好，即做出的有利選擇更多。兩種環境條件下的供試豬只在技能保留階段沒有差異。貧瘠環境下生長的豬毛發皮質醇濃度較高，表明貧瘠環境比富集環境下生長的豬會經受更多的應激壓力。

參考文獻略